解脂耶氏酵母单细胞水平基因与蛋白表达定量分析揭示Xbp1p调控脂质代谢的异质性机制

本研究通过单分子荧光原位杂交(smFISH)和qPCR技术，在解脂耶氏酵母中首次实现XBP1/ELO2/TGL1基因转录与Xbp1p蛋白表达的同步定量分析，揭示氮限制条件下转录因子Xbp1p通过调控脂肪酸延伸酶Elo2p介导脂质积累的细胞间异质性，为微生物脂质工程提供单细胞尺度调控新见解。

　　

在微生物代谢工程领域，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)因其卓越的脂质积累能力成为生物燃料生产的明星菌种。然而，传统群体水平的研究方法掩盖了细胞间的异质性，使得关键调控因子Xbp1p在氮限制条件下介导脂质代谢的精确机制始终存在认知空白。这种认知局限严重制约了理性设计高产菌株的精准度——当30%的细胞贡献70%的脂质产量时，群体平均值显然无法揭示真正的调控规律。

美国能源部下属环境分子科学实验室的研究团队在《Current Research in Microbial Sciences》发表的研究，首次将单分子荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术与蛋白质荧光标记相结合，在单细胞分辨率下绘制了解脂耶氏酵母的基因-蛋白表达图谱。研究人员创新性地采用波动定位成像技术(fluctuation localization imaging-based FISH, fliFISH)，通过捕捉荧光分子的"闪烁"特征显著提升信噪比，实现对XBP1、ELO2和TGL1 mRNA分子的精确定量，同时利用基因组整合的Xbp1p-GFP融合蛋白追踪翻译水平动态。

关键技术包括：(1) 设计靶向XBP1/ELO2/TGL1 mRNA的多重fliFISH探针系统；(2) 构建XBP1基因敲除(Δxbp1)和Xbp1p-GFP标记菌株；(3) 在氮限制条件下进行时间序列采样(0/1/4/24 h)；(4) 并行开展单细胞smFISH成像与群体水平qPCR验证；(5) 采用CellPose软件进行细胞形态量化分析。

【主要结果】

1. 蛋白定位可视化：共聚焦显微镜显示Xbp1p-GFP在氮限制24小时后显著核定位，脂滴相关酶Tgl1p-GFP和脂肪酸延伸酶Elo2p-GFP分别呈现膜周与内质网的特异性分布，且存在明显细胞间差异。

2. 单细胞表达异质性：

   • XBP1 mRNA在野生型细胞中呈现超泊松分布(0h:18±17；24h:56±31拷贝/细胞)
   • Xbp1p蛋白与mRNA的相关性微弱(Pearson=0.10)，揭示转录后调控的重要性
   • 细胞大小与转录/翻译水平无显著相关性，排除体积效应

3. 调控网络特征：

   • Δxbp1突变导致ELO2丧失氮响应性(24h:28±14 vs WT:53±22拷贝)
   • 野生型中XBP1-ELO2的转录相关性随胁迫增强(0h r=0.22→24h r=0.36)
   • TGL1表达独立于Xbp1p调控(11±5拷贝)，体现通路特异性

4. 方法学突破：

   • fliFISH在酵母中实现<1%假阳性率
   • 首次在真菌中同步定量3个基因转录与对应蛋白表达

【结论与意义】
该研究揭示了解脂耶氏酵母应对氮限制的"分子决策"多样性：虽然群体水平显示Xbp1p通过上调ELO2促进脂质积累，但单细胞数据表明这种调控存在显著的时间异步性和细胞特异性。约15%的细胞表现出"超前响应"特征(XBP1^high/ELO2^high)，而相当比例细胞维持基础表达水平，这种异质性很可能是进化赋予的代谢风险分摊策略。

技术层面，建立的fliFISH-荧光蛋白双读出系统为微生物单细胞多组学研究树立了新标准，特别适用于CRISPR筛选库的表型鉴定。应用层面，发现Xbp1p对ELO2的"松散调控"特征提示：在代谢工程中过度增强转录因子活性可能适得其反，而筛选天然高响应亚群或能更有效提升脂质产量。该工作为理解微生物群体中的"细胞社会学"提供了分子显微镜，也为工业菌株的精准设计提供了新范式。