藜麦蛋白水解物中新型抗氧化肽的纯化鉴定及其通过Keap1-Nrf2通路调控氧化应激的分子机制

本研究针对氧化应激引发的健康问题，从藜麦蛋白水解物中筛选出11种新型抗氧化肽，通过计算机辅助筛选和分子对接技术揭示其与Keap1-Nrf2通路的相互作用。关键肽段GF-11显著降低ROS（43.20%）和MDA（1.92 nmol/mg），提升SOD（25.33 U/mg）、GSH-Px（133.99 U/mg）及CAT（43.20 U/mg）活性，证实其通过竞争性结合Keap1激活Nrf2通路，为功能性食品开发提供理论依据。

　　

氧化应激是导致衰老和多种疾病的关键因素，当体内活性氧（ROS）积累超过抗氧化防御能力时，会引发DNA损伤、脂质过氧化等病理变化。虽然合成抗氧化剂广泛应用，但其潜在毒性促使研究者转向天然来源的生物活性肽。藜麦（Chenopodium quinoa wild.）作为安第斯地区的“超级食物”，其蛋白质富含均衡氨基酸且无麸质，但此前对其抗氧化肽的结构特征及作用机制研究不足。

为解决这一问题，中国的研究团队通过酶解组合技术制备藜麦蛋白水解物，结合LC-MS/MS和计算机辅助筛选，从341种肽段中锁定11种新型抗氧化肽。分子对接显示GPGGGGKGEMF（GF-11）与Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）结合能力最强。细胞实验证实，GF-11将氧化损伤的RAW264.7细胞内ROS和MDA分别降至43.20%和1.92 nmol/mg蛋白，同时显著提升SOD（25.33 U/mg）、GSH-Px（133.99 U/mg）和CAT（43.20 U/mg）活性。机制研究表明，GF-11通过竞争性占据Keap1的Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）结合位点，促进Nrf2核转位，上调HO-1和NQO1表达，从而激活Keap1-Nrf2-ARE通路。该成果发表于《Food Chemistry》，为天然抗氧化剂开发提供了新策略。

关键技术包括：1）碱性蛋白酶与胰蛋白酶分步酶解制备多肽；2）LC-MS/MS鉴定肽序列；3）计算机模拟预测肽段稳定性与毒性；4）分子对接分析Keap1相互作用；5）RAW264.7细胞氧化损伤模型评估活性。

材料与方法
研究采用酶解组合技术（碱性蛋白酶+胰蛋白酶）制备藜麦蛋白水解物，通过超滤和Sephadex G-25层析分级纯化，结合LC-MS/MS鉴定肽序列。采用DPPH和ABTS自由基清除实验初筛活性，进一步通过分子对接预测肽段与Keap1的结合模式。

结果与讨论

1. 肽段筛选与表征：从A-T-QPH-III组分中鉴定出341种肽段，计算机辅助筛选出11种具有高稳定性、无致敏性的抗氧化肽，以GF-11（GPGGGGKGEMF）活性最显著。
2. 分子机制：GF-11通过氢键和疏水作用占据Keap1的Nrf2结合域（结合能-9.5 kcal/mol），促进Nrf2核转位，上调HO-1和NQO1表达量达2.1倍。
3. 细胞保护效应：在H₂O₂诱导的氧化损伤模型中，GF-11使SOD活性提升至25.33 U/mg蛋白，GSH-Px活性达133.99 U/mg蛋白，显著优于阳性对照（p<0.05）。

结论
该研究首次阐明藜麦抗氧化肽通过Keap1-Nrf2通路调控氧化应激的分子机制，GF-11的强效抗氧化特性为功能性食品开发提供了科学依据。未来可进一步探索其体内代谢稳定性及工业化应用潜力。