基于CHO-K1细胞稳定表达LSDV P32蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立及其在牛结节性皮肤病防控中的应用

本研究针对牛结节性皮肤病(LSD)缺乏快速灵敏的血清学检测方法这一难题，中国兽医药品监察所团队成功构建了CHO-K1悬浮细胞稳定表达系统生产LSDV P32蛋白，并以此建立间接ELISA检测方法。该方法对Capripoxvirus(CaPV)抗体检测具有高度特异性（最大稀释度1:3200）和重复性（批间变异系数<10%），与商品化试剂盒符合率达95.7%，为LSDV临床检测和疫苗免疫评估提供了经济高效的技术方案。

　　

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease, LSD)这个听起来颇具画面感的疾病，正在全球畜牧业掀起一场"皮肤保卫战"。由LSDV病毒引起的这种传染病，不仅会让牛群出现特征性的皮肤结节、高烧和淋巴肿大，更因其高达50%的发病率和显著的经济损失，被世界动物卫生组织(WOAH)列为必须通报的疫病。随着病毒从非洲向亚洲、欧洲的快速扩张，中国自2019年首次报道疫情后，防控形势日益严峻。然而当前诊断主要依赖病毒分离、PCR等耗时耗力的方法，而市售ELISA试剂盒又面临价格昂贵、全病毒抗原制备困难等问题。这场"战痘"行动亟需新的检测武器。

中国兽医药品监察所联合其他机构的研究团队在《BMC Biotechnology》发表的研究，将目光锁定在LSDV的"身份证"——P32蛋白上。作为病毒表面的主要结构蛋白，P32具有极强的免疫原性且与山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)存在97%的序列同源性，是理想的血清学检测靶标。但该蛋白存在表达难、产量低的产业化瓶颈。研究团队创新性地采用CHO-K1哺乳动物表达系统，通过低温诱导策略成功获得高纯度P32蛋白，并据此建立间接ELISA方法。令人振奋的是，该方法不仅能准确区分疫苗接种与自然感染，对GTPV疫苗免疫血清也表现出优异检测性能，为当前中国使用五倍剂量山羊痘活疫苗防控LSD的特殊国情提供了精准监控工具。

关键技术方法包括：1) 生物信息学预测P32蛋白信号肽和跨膜区，设计真核表达载体；2) 采用电转染和甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)筛选建立CHO-K1稳定表达细胞系；3) 33℃低温诱导配合分批补料策略提高蛋白产量；4) 棋盘滴定法优化ELISA条件（46份阳性血清和33份阴性血清验证）；5) ROC曲线确定0.262的cut-off值。

【Construction and identification of the expression plasmid】
团队首先上演了一场"基因剪刀戏法"：通过SignalP和TMHMM软件预测，设计去除跨膜区的P32截短体基因，并添加AZ信号肽和His标签。双酶切鉴定和测序确认重组质粒PEE12.4-P32构建成功，为后续表达奠定基础。

【Expression and purification of recombinant P32 protein】
在CHO-K1细胞中的"蛋白工厂"展现惊人效率：低温诱导7天后，蛋白表达量达到峰值，每100mL培养上清可获得7.5mg纯度80%的P32蛋白。Western blot显示该蛋白能被LSDV阳性血清特异性识别，但存在二聚体和降解条带，提示需进一步优化保存条件。

【Establishment of an indirect ELISA method】
经过系统优化的"检测流水线"最终参数亮眼：4μg/mL CBS缓冲液4℃包被12小时，1:200血清稀释度，1:3000酶标抗体比例，20分钟显色时间。这些精细调整使P/N值高达7.768，远超原方案。

【Determination of the cut-off value】
ROC曲线分析展现诊断价值：在94.44%灵敏度和100%特异性的黄金平衡点，确立0.262为临界值。这个数字背后是72份VNT验证血清的严格测试。

【Sensitivity assessment】
稀释度挑战赛创下纪录：阳性血清在1:3200稀释时仍高于cut-off值，灵敏度比原大肠杆菌表达系统提高4倍，堪称血清学检测的"显微镜"。

【Specificity assessment】
交叉反应测试表现完美：与BVDV、BRV、IBRV和布鲁氏菌阳性血清均无交叉，唯独对GTPV阳性血清有反应——这恰证实了CaPV属的抗原交叉性，反而成为方法优势。

【Reproducibility assessment】
"五批连测"稳定性惊艳：批内变异系数2.91-6.48%，批间4.55-9.94%，这些数字让该方法跻身可工业化生产的可靠检测体系。

这项研究突破性地解决了P32蛋白产业化表达难题，其建立的ELISA方法相比商品化试剂盒每板可节省约500元成本。特别值得注意的是，该方法对中国当前使用的GTPV疫苗免疫血清检测效果良好，为"异源疫苗"的免疫评价提供了关键工具。尽管在蛋白稳定性和少量样本（4/93）的假阳性问题上仍需改进，但已为LSD防控提供了国产化检测方案。随着该技术推广应用，将显著提升我国对这类跨界动物疫病的监测预警能力，为全球LSD防控贡献"中国方案"。