DNA G-四链体结构作为α-和β-珠蛋白增强子的功能元件调控三维染色质互作与基因表达

本研究针对增强子如何通过三维染色质互作调控远端基因表达这一核心科学问题，通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术，首次揭示α-和β-珠蛋白基因座控制区(LCR)中G-四链体(G4)结构的形成对维持开放染色质状态、招募RNA聚合酶II(RNAPII)及调控增强子-启动子互作的关键作用。研究发现破坏HS-40和HS2增强子中的G4结构会导致HBA1和HBE1基因表达异常，而通过异源G4序列恢复结构可挽救基因表达缺陷，为血红蛋白疾病的治疗提供了新靶点。该成果发表于《Genome Biology》，为理解非编码区DNA二级结构在基因调控中的功能提供了范式转变。

　　

在生命活动的精密调控网络中，增强子如同隐藏在DNA序列中的"远程控制器"，能够跨越数万碱基的距离精准调控基因表达。然而，这些神秘的DNA片段究竟如何"隔空取物"般与目标基因对话，始终是表观遗传学领域亟待破解的谜题。近年来，DNA二级结构G-四链体(G-quadruplex, G4)在基因调控中的作用逐渐浮出水面——这种由鸟嘌呤通过Hoogsteen碱基配对形成的特殊结构，在启动子区域已被证明能像"分子开关"一样调控转录过程。但令人困惑的是，虽然生物信息学预测显示40%的增强子含有G4形成序列，这些结构在增强子中的功能却如同"暗物质"般未被探索。

剑桥大学癌症研究中心的研究团队选择α-和β-珠蛋白基因座作为突破口，这不仅因为它们是研究增强子功能的经典模型，更因其调控异常会导致地中海贫血等严重血红蛋白病。通过整合G4特异性抗体CUT&Tag、4C-seq三维基因组学、CRISPR-Cas9基因组编辑及蛋白质组学等多学科技术，研究人员首次绘制出珠蛋白增强子中功能性G4结构的精确图谱，并揭示这些结构在维持染色质开放状态、介导远程互作中的核心作用。相关成果发表在《Genome Biology》杂志，为理解DNA二级结构在基因调控中的功能开辟了新视角。

关键技术方法包括：1)使用BG4/SG4抗体通过CUT&Tag在K562红细胞白血病细胞中定位G4结构；2)设计特异性突变破坏HS-40和HS2增强子的G4形成能力，并通过圆二色谱验证结构变化；3)应用4C-seq分析三维染色质互作改变；4)开发ViCAR技术同步检测G4结构与染色质互作；5)结合质谱分析鉴定G4结合蛋白。

【Fold G-quadruplex structures form in α- and β-globin enhancers】
研究人员首先在人类K562细胞中证实，α-珠蛋白基因座的HS-40增强子和β-珠蛋白基因座的HS2增强子中存在折叠的G4结构。通过G4特异性抗体BG4和SG4的CUT&Tag检测，发现这些结构恰好位于具有增强子活性的DNase I超敏感位点(HS)区域。创新的ViCAR技术进一步显示，这些G4结构在三维空间上与远端基因保持互作状态，暗示其可能作为"分子锚点"参与染色质环的形成。

【Mutation disrupts G4 structure formation in α- and β-globin enhancers】
团队设计了精妙的CRISPR-Cas9编辑策略：在HS-40和HS2中分别引入7个和11个鸟嘌呤突变(aMut和βMut)，这些突变特异破坏Hoogsteen键形成而不影响转录因子结合位点。圆二色谱和紫外熔解实验证实突变完全消除了G4特征信号。更重要的是，在细胞模型中这些突变使内源性G4信号降至野生型的30-39%，而其他位点的G4结构不受影响，证明编辑的高度特异性。

【Restoration of enhancer G4 structure formation by an unrelated G4 sequence】
为排除序列改变带来的间接效应，研究进行了"基因手术"般的结构回补实验——将MYC基因启动子的27bp G4序列插入突变体。令人振奋的是，这种"异源移植"使HS-40的G4信号恢复至野生型的81%，表明不同序列的G4结构在功能上具有可替换性，其三维构象而非特定序列才是功能核心。

【Folded G4s at enhancers promote chromatin accessibility】
通过CUTAC技术发现，G4缺失导致HS-40和HS2的染色质可及性下降60%以上，且影响范围超出G4位点本身达120bp。这种"染色质紧缩"效应在回补细胞中完全逆转，说明G4结构如同" chromatin opener"，通过维持局部核小体缺失状态为转录机器提供结合界面。这一发现将DNA二级结构与表观遗传调控直接联系起来。

【G4s facilitate 3D α-globin enhancer-target gene interactions】
4C-seq分析揭示出G4调控的三维基因组"地形图"：在野生型细胞中，HS-40增强子与上游70kb和下游60kb区域形成对称互作；而aMut细胞出现选择性缺陷——仅上游互作(含HBA1基因)减少50%。这种"方向性破坏"伴随H3K27ac修饰水平下降和HBA1表达降低40%，表明G4结构可能作为"指南针"定向引导增强子寻找特定靶基因。回补实验则显示，异源G4不仅能恢复原有互作模式，甚至产生更强的调控效应。

【The HS2 β-globin locus enhancer G4 co-operates with HS3 to promote target gene interactions】
β-珠蛋白基因座展现出更复杂的调控网络：HS2 G4缺失虽使该增强子与HBE1基因的互作减少80%，但邻近的HS3增强子却出现"代偿性激活"——与下游基因的互作显著增强。这种"增强子重组"现象解释了为何单独HS2 G4突变对HBE1表达影响有限。而双敲除实验(βMut-HS3△)则导致HBE1表达暴跌至9%，揭示不同增强子间的G4结构通过"接力协作"确保基因表达的稳定性。

【Enhancer G4s bind and organize RNA polymerase II occupancy on chromatin】
质谱分析发现α-珠蛋白增强子G4特异性结合RNAPII亚基POLR2A/POLR2C，ELISA证实POLR2G与G4的直接互作(K_d
=52.8 nM)。在细胞中，G4缺失使HS-40的RNAPII 5SP信号减半，而在βMut细胞中RNAPII则"转位"至HS3增强子。这种"RNAPII重分布"现象与三维互作改变完美对应，说明G4可能作为"分子诱饵"通过招募转录机器来稳定染色质环。

这项研究突破了传统增强子研究的序列中心论，首次确立G4结构作为独立的功能元件调控三维基因组组织和基因表达的工作模型。其科学意义体现在三个维度：在机制上，揭示了DNA二级结构通过"三位一体"（维持开放染色质、招募RNAPII、稳定远程互作）调控基因表达的新范式；在方法学上，开发的"突变-回补"策略为研究非编码区结构功能树立了标杆；在医学应用上，为地中海贫血等血红蛋白病的基因治疗提供了新靶点——未来或可通过小分子稳定特定G4结构来纠正珠蛋白表达失衡。值得注意的是，约40%的细胞类型特异性增强子含有G4结构，这一发现或将重新定义我们对细胞命运决定中表观遗传调控的理解边界。