微量大麦根际样本通过总RNA测序揭示稳定微生物群落结构与多样性的可行性研究

本研究针对根际微生物研究中样本量受限的难题，创新性地采用总RNA测序技术（含16S/18S rRNA），通过对比10/40/200 mg三种冻干样本量，证实微量样本仍能准确反映大麦根际活性微生物群落结构与多样性特征。该成果为低生物量环境微生物研究提供了方法学突破，对植物-微生物互作机制研究具有重要方法论意义。

　　

在植物与微生物的复杂共生关系中，根际作为"微生物热点区域"始终是研究焦点。传统DNA测序无法区分活性与非活性微生物，而总RNA测序虽能通过检测核糖体RNA（rRNA）解决这一问题，却面临样本需求量大的技术瓶颈。更棘手的是，根际微生物的空间异质性使得微量样本可能丢失关键生物信息，这种矛盾严重制约着植物-微生物互作机制的深入研究。

丹麦哥本哈根大学领衔的国际团队在《Plant Methods》发表创新性研究，通过设计惰性基质（沙-珍珠岩混合）培养系统，采用三种样本量（10/40/200 mg）进行总RNA提取，结合SSU rRNA测序分析，首次系统评估了样本量对根际活性微生物检测的影响。研究发现尽管10 mg样本RNA提取量显著降低，但微生物群落α多样性（Chao1指数和Shannon指数）和β多样性（PCoA分析）均保持稳定，且真核微生物（如真菌、原生生物）与原核微生物表现一致。该成果为微量根际样本研究提供了可靠方法学支持，对精准农业和可持续生态系统研究具有重要价值。

关键技术包括：1）惰性生长系统构建（550℃热处理沙-珍珠岩基质）；2）土壤悬液接种大麦种子建立简化微生物群落；3）PBS缓冲液根际洗脱结合冻干处理；4）AllPrep PowerFecal Pro试剂盒微量RNA提取；5）Illumina NextSeq 500平台进行非扩增SSU rRNA测序；6）Kaiju软件基于nr+euk数据库进行物种注释。

【微生物群落组成与多样性】通过分析2873个OTUs（操作分类单元）发现，样本量对优势菌门（如变形菌门Proteobacteria）和属水平分布无显著影响。

图示三种样本量在门/属水平的群落结构高度一致。

【α多样性分析】Kruskal-Wallis检验显示，样本量对Chao1丰富度指数（p=0.82）和Shannon多样性指数（p=0.91）无统计学影响，但个体植物差异显著（p<0.05）。

证实微量样本保持多样性检测的可靠性。

【β多样性分析】PCoA（主坐标分析）显示样本按植物个体聚类（PERMANOVA效应量85%），而非样本量。

表明微生物群落差异主要源于生物因素而非技术因素。

【方法学验证】随机抽取1379个OTUs的亚组分析结果与全数据集一致，证实结论的稳健性。值得注意的是，RNA浓度与样本量呈显著正相关（R²
=0.76），但此差异未转化为生物学信息损失。

该研究颠覆了"样本量决定检测灵敏度"的传统认知，揭示RNA测序对活性微生物检测具有特殊优势——可能由于活性微生物在群落中占主导地位。研究同时发现个体植物对根际微生物组的塑造作用超预期，推测与种子微生物组遗传差异或根系分泌物变异有关。这种简化生长系统（排除土壤有机质干扰）为解析植物-微生物互作本质提供了独特视角。

技术层面，该方案实现了三项突破：1）将常规样本量降低20倍（200 mg→10 mg）；2）首次验证真核/原核微生物同步检测的稳定性；3）建立惰性基质-气候室标准化研究体系。这些进展为根际分区（rhizosphere/rhizoplane/endosphere）研究、稀有物种追踪以及田间微量样本分析铺平道路。未来研究可拓展至mRNA功能分析领域，并探索该技术在逆境生理研究中的应用潜力。