微肽“终止开关”揭示生物分子凝聚体微环境的功能奥秘

为解决生物分子凝聚体（biomolecular condensates）微环境功能研究的工具匮乏问题，研究人员开发了一种非天然微肽“终止开关”（killswitch）及纳米抗体靶向系统，成功揭示了凝聚体微环境对核仁、癌蛋白凝聚体及腺病毒核内体的组成、动力学及功能的调控机制。该研究为理解凝聚体在生理病理过程中的作用提供了通用工具，发表于《Nature》。

　　

生物分子凝聚体（biomolecular condensates）是细胞内无膜包裹的动态结构，通过液-液相分离形成独特的微环境，参与基因调控、信号传导等关键生命活动。然而，现有工具难以特异性操控内源性凝聚体的物理化学性质，限制了对其功能机制的解析。尤其在与癌症、病毒感染等疾病相关的病理凝聚体中，微环境如何影响功能仍知之甚少。

为解决这一难题，德国马克斯·普朗克分子遗传学研究所等机构的研究人员开发了一种名为“终止开关”（killswitch）的合成微肽系统。该微肽由17个氨基酸组成，富含疏水性和芳香族残基，能够通过自聚集改变凝聚体的材料性质。结合纳米抗体靶向技术，研究人员成功将killswitch定向招募至核仁、癌蛋白凝聚体及腺病毒核内体，揭示了微环境对蛋白质非化学计量富集、运动性及功能的调控作用。相关成果发表于《Nature》。

研究团队首先通过基因编辑构建了内源性GFP标记的核仁蛋白NPM1、核斑蛋白SRRM2等细胞系，利用荧光漂白恢复（FRAP）和新型核荧光激活非膜凝聚体分离技术（NuFANCI），结合质谱分析，发现killswitch可选择性改变核仁组成，抑制核糖体蛋白RPL18的流动性，并导致5.8S rRNA空间分布异常。在融合癌蛋白BRD4::NUT和NUP98::KDM5A驱动的白血病模型中，killswitch通过固化凝聚体抑制RNA聚合酶II（RNAPII）的招募和转录活性，显著阻断了癌细胞增殖。此外，killswitch对腺病毒52K核内体的靶向导致衣壳蛋白IIIa的分配障碍，病毒颗粒组装效率下降90%。

关键技术包括：

1. 设计非天然微肽killswitch及其突变体，通过AlphaFold 3预测结构；
2. 纳米抗体靶向系统（如抗GFP纳米抗体）实现内源性凝聚体特异性操控；
3. 荧光漂白恢复（FRAP）和活细胞成像分析蛋白质动力学；
4. 核荧光激活非膜凝聚体分离（NuFANCI）联合质谱解析组分变化；
5. 小鼠急性髓系白血病（AML）模型评估killswitch的治疗潜力。

主要研究结果：

1. killswitch的特征与机制：
   突变分析表明，killswitch中三个苯丙氨酸（F）簇是其自聚集和固化凝聚体的关键，体外液滴实验证实其可浓度依赖性形成多聚体。与TDP-43疏水斑块不同，killswitch通过独特机制改变凝聚体材料性质。

2. 内源性凝聚体的靶向操控：
   纳米抗体系统将killswitch精准递送至核仁（NPM1）、核斑（SRRM2）等结构，显著降低蛋白质流动性。双拷贝killswitch（2xKS）效果更显著，导致核斑蛋白异常聚集。

3. 核仁微环境的重编程：
   NuFANCI分离的核仁蛋白质组显示，killswitch使20种RNA结合蛋白显著缺失，包括NPM1互作伙伴NEPRO，同时抑制核糖体组装相关蛋白的动力学。

4. 癌蛋白凝聚体的功能干预：
   在BRD4::NUT模型中，killswitch减少RNAPII在凝聚体的富集，下调致癌靶基因表达；在NUP98::KDM5A驱动的AML中，killswitch通过蛋白酶体依赖途径降解癌蛋白，完全抑制白血病细胞增殖。

5. 病毒组装机制的破坏：
   killswitch修饰的腺病毒52K蛋白形成不可逆固化凝聚体，阻断衣壳蛋白IIIa的分配，病毒粒子产量降低90%，AlphaFold模型显示此效应独立于直接相互作用界面。

6. 跨物种应用的普适性：
   在斑马鱼胚胎中，killswitch融合蛋白NANOG抑制转录小体内的microRNA生成，证实其跨物种适用性。

该研究首次建立了一种普适性工具，通过操控凝聚体微环境揭示其生理病理功能。killswitch不仅为癌症、病毒感染等疾病的机制研究提供新范式，其模块化设计（如细胞穿透肽R10偶联）更展现出治疗潜力。未来或可针对特定疾病设计微肽变体，实现精准医疗。研究同时提出“凝聚体微环境通过非化学计量分配调控效应蛋白功能”的新理论，为相分离领域开辟了研究方向。