基于微阵列技术的端粒酶结合 assay 开发揭示细胞松弛素衍生物4'-碘代细胞松弛素H的非典型抑制作用

本研究针对端粒酶逆转录酶(TERT)在癌症治疗和细胞再生中的关键作用，开发了一种新型微阵列结合 assay，成功鉴定了绿茶多酚EGCG和4'-碘代细胞松弛素H(4'-I-C)作为端粒酶抑制剂。通过AlphaFold3结构预测和TRAP活性验证，揭示了4'-I-C通过干扰端粒酶RNA模板(TERC)结合发挥抑制作用，为靶向端粒酶的药物开发提供了高效筛选平台。

　　

端粒酶逆转录酶(TERT)作为维持染色体稳定的核心元件，其异常激活与85%的恶性肿瘤永生化和90%的干细胞衰竭性疾病密切相关。然而传统TRAP assay（端粒重复序列扩增协议）存在操作复杂、通量低的瓶颈，且现有TERT抑制剂如BIBR1532存在选择性差的问题。针对这些挑战，德国汉诺威医学院联合莱布尼茨大学的研究团队在《Scientific Reports》发表创新成果，开发出首个基于微阵列的端粒酶结合检测技术。

研究采用非接触式点样技术将纯化TERT蛋白或癌细胞裂解液固定于硝化纤维素微阵列，结合荧光标记引物(Cy5-TTAGGG₃
)、TERC RNA和Cy5-ATP的"引物鸡尾酒"系统。通过微尺度热泳动(MST)验证结合亲和力，并运用AlphaFold3预测了EGCG与4'-I-C在TERT上的结合位点。关键样本包括HeLa细胞裂解液和重组大肠杆菌表达的TERT蛋白，4'-I-C则通过Pyricularia grisea真菌突变株生物合成获得。

Development of a microarray based telomerase binding assay
研究团队建立的微阵列 assay 灵敏度达1.26-1.76 μM（EGCG），仅需800 pL样本即可完成单次检测。与传统方法相比，该技术使单次50 μL样本可完成上千次检测，且固定化蛋白稳定性达1个月。

Evaluation of the binding affinity of epigallocatechin-3-gallate(EGCG) for TERT
通过剂量梯度实验证实EGCG以剂量依赖方式抑制TERT结合（EC₅₀
1.26 μM），与TRAP assay显示的1-15 μM抑制区间一致。AlphaFold3模型显示EGCG通过-3.6 kcal/mol结合能占据ATP位点，与镁离子协同作用。

Microarray-based TERT binding activity in presence of cytochalasan derivatives
在8种细胞松弛素衍生物筛选中，4'-I-C表现出独特抑制特性（EC₅₀
2.76-4.41 μM）。TRAP验证显示其抑制作用具有镁离子浓度依赖性（5 mM有效而10 mM失效），分子对接提示其通过碘原子与镁离子互作干扰DNA引物结合。

这项研究突破了端粒酶抑制剂筛选的技术壁垒，首次揭示细胞松弛素类化合物可通过非肌动蛋白靶点调控端粒酶。微阵列技术的微型化特性（单点仅需0.8 nL）为大规模化合物库筛选奠定基础。特别值得注意的是，4'-I-C的抑制作用依赖于镁离子浓度，这为理解端粒酶活性调控提供了新视角。研究提出的"引物鸡尾酒"策略可同步检测结合与抑制效应，未来既可拓展至激活剂筛选，也能应用于其他核酸-蛋白互作体系。该成果对开发新一代靶向端粒酶的抗癌药物具有重要指导价值。