突变育种与基因修饰协同增效：提升油井土著铜绿假单胞菌鼠李糖脂产量的创新策略

为解决鼠李糖脂(RLs)工业化生产产量不足的瓶颈问题，山东大学微生物技术国家重点实验室团队创新性地结合ARTP/UV/EMS复合诱变与强启动子替换技术，对油井土著菌株Pseudomonas aeruginosa SH6进行定向改造。研究成功获得遗传稳定的重组菌株P. aeruginosa APA1，其RLs产量达7.59 g/L，较原始菌株提升4.67倍，为微生物采油(MEOR)提供了高性能工程菌种。

　　

在能源需求持续增长与环境压力加大的双重背景下，微生物采油技术(MEOR)因其环境友好特性成为石油工业的研究热点。作为性能最优异的生物表面活性剂，鼠李糖脂(RLs)能显著降低油水界面张力，但其工业化应用长期受限于生产菌株产量低、发酵周期长、底物成本高等瓶颈。传统化学合成表面活性剂存在环境污染风险，而野生型Pseudomonas aeruginosa产生的RLs产量普遍不足1.5 g/L，且油井极端环境适应性差，这促使研究人员寻求突破性的菌株改良策略。

山东大学微生物技术国家重点实验室的Mingxin Liu、Jin Sun和Xin Song团队在《Scientific Reports》发表的研究中，通过多维度技术联用实现了RLs产量的阶梯式提升。研究首先采用ARTP(常压室温等离子体)、紫外线和EMS(甲基磺酸乙酯)三重诱变技术对油井土著菌P. aeruginosa SH6进行多轮筛选，获得产量5.05 g/L的突变株EZD3；继而通过替换rhlABRI基因的天然启动子为czcC/pilG强启动子，构建出产量7.32 g/L的重组菌APA1；最终经碳源优化使产量进一步提升至7.59 g/L。关键技术包括：复合物理化学诱变筛选、强启动子替换的基因工程改造、基于砷抗性标记的转化体系，以及碳氮比优化等发酵工艺调控。

在诱变育种方面，研究系统比较了单一与复合诱变效果。ARTP处理7-11秒（致死率>80%）获得RLs产量3.12 g/L的突变株D1；UV诱变最佳处理时间5-15秒，突变株Z32产量达2.99 g/L；0.4% EMS处理30分钟产生的突变株E6产量为2.75 g/L。通过ARTP-UV-EMS阶梯式复合诱变，最终获得的EZD3菌株产量突破5.05 g/L，且经五代传代验证其遗传稳定性良好。

基因工程改造环节聚焦于rhamnosyl transferase（鼠李糖基转移酶）合成途径的关键基因簇rhlABRI。研究人员创新性地选用铜绿假单胞菌自身的czcC和pilG强启动子替代天然启动子，避免了外源启动子的表达兼容性问题。在添加400μM Zn²⁺
诱导条件下，czcC启动子驱动的重组菌RLs产量达5.69 g/L；而pilG启动子改造的APA1菌株更展现出7.32 g/L的高产性能，体积生产率较原始菌提升77.2%。

发酵优化研究揭示了甘油作为碳源的优越性，2%浓度下产量达4.81 g/L；碳氮比19时产量提升至4.8 g/L。值得注意的是，重组菌APA1在3%菜籽油为碳源时产量达7.59 g/L，显示出对工业廉价原料的良好适应性。

该研究通过传统诱变与现代基因技术的协同创新，实现了三个关键突破：一是创制出适应油井环境的高产菌株，解决了工程菌环境适应性难题；二是首次采用内源强启动子调控rhlABRI表达，避免了异源表达系统的代谢负担；三是建立了完整的从诱变筛选到基因改造的RLs增产技术路线。这些成果不仅为MEOR提供了可直接应用的菌种资源，其"诱变-基因修饰-工艺优化"的三步法策略更为其他微生物次级代谢产物的产量提升提供了范式参考。研究揭示的启动子替换对rhamnosyl transferase表达水平的精确调控机制，也为合成生物学在Pseudomonas属的应用开辟了新思路。