AI辅助荧光显微系统实现线粒体自噬诱导剂的高通量筛选——同步解析线粒体自噬中间体改善阿尔茨海默病病理

本研究开发了AI-FM系统，通过pH响应荧光探针Mcy3和深度学习模型DMAN，首次实现了活细胞中线粒体自噬全过程（包括线粒体、自噬体和溶酶体融合中间体）的动态可视化与定量分析。团队通过虚拟筛选发现SIRT1激动剂Y040-7904能显著促进线粒体向自噬体转运（9%）及自噬体-溶酶体融合（18%），并通过SIRT1/FoxO3通路改善AD模型中的Aβ病理。该系统为神经退行性疾病治疗提供了新型药物筛选平台和机制研究工具。

　　

在神经退行性疾病研究中，线粒体质量控制失衡是核心病理机制之一。线粒体自噬（mitophagy）作为选择性清除受损线粒体的关键过程，其功能障碍会导致神经元内异常线粒体堆积，进而加速β淀粉样蛋白（Aβ）沉积——这是阿尔茨海默病（AD）的典型病理特征。尽管已有多种荧光标记技术（如mt-Keima、RFP-GFP-LC3）用于监测线粒体自噬，但现有方法存在三大瓶颈：无法区分非选择性自噬与线粒体自噬、难以同步捕捉不同自噬阶段中间体、依赖人工定量导致通量低下。更关键的是，传统技术无法解析药物干预究竟作用于自噬体形成还是溶酶体融合阶段，极大限制了靶向药物的开发效率。

为解决这一难题，复旦大学药学院联合生物医学工程学院的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果。研究开发了人工智能辅助荧光显微系统（AI-FM），通过整合pH敏感型线粒体探针与多尺度深度学习算法，首次实现了线粒体自噬全过程的无间断动态追踪与定量分析。该系统不仅成功筛选出新型线粒体自噬诱导剂Y040-7904，更揭示了其通过SIRT1/FoxO3a/PINK1通路改善AD病理的分子机制，为神经退行性疾病治疗提供了全新策略。

关键技术方法
研究采用三级技术体系：1）设计线粒体靶向pH探针Mcy3，其荧光比率（I₆₆₀
/I₅₆₀
）可敏感反映线粒体从生理pH 7.5-8.0到自噬溶酶体pH 4.5-5.9的动态变化；2）构建双分支多尺度注意力残差网络（DMAN），通过分析线粒体形态（128×128像素窗口）和pH特征（32×32像素窗口）实现三类中间体的自动分类，测试集准确率达86%；3）结合SIRT1蛋白的虚拟筛选（200万化合物库）和AI-FM验证，发现先导化合物Y040-7904（K_d
=191.7 nM）。实验模型涵盖HT22神经元细胞、APP^swe
突变AD细胞模型及转基因线虫CL4176/CL2006。

研究结果

探针设计与验证
团队开发的FRET探针Mcy3在线粒体靶向性（与Mitotracker共定位系数0.92）和pH响应范围（pKa 4.6）上表现优异。在CCCP诱导的线粒体自噬模型中，Mcy3准确捕捉到线粒体pH从7.46降至5.45的过程，并通过与GFP-LC3/Lysotracker共定位证实自噬体形成（2小时达峰值43.6个/细胞）和溶酶体融合（3小时33个/细胞）的动态变化。

AI量化系统构建
DMAN模型通过卷积注意力模块（CBAM）同步提取形态与功能特征，在抑制自噬（Bafilomycin A1处理）时准确识别出自噬体累积（39%），而在DFP诱导下检测到溶酶体比例升至14.7%。相较单分支模型，双特征融合使分类准确率提升12%。

药物筛选与机制
Y040-7904处理24小时使溶酶体包裹线粒体比例达18%，显著高于阳性对照Urolithin A（13%）。机制研究表明：1）激活SIRT1促进FoxO3a核转位，上调PINK1/Parkin表达；2）增强线粒体生物发生（MFN2、PGC1α增加）；3）在AD模型中降低Aβ_1-42
水平达47%（细胞）和29.3%（线虫瘫痪率）。PINK1敲除可完全阻断上述效应，证实通路依赖性。

结论与意义
该研究建立了首个能同步解析线粒体自噬全流程的AI量化系统，其创新性体现在：1）单探针实现多阶段监测，克服传统多染料标记的光谱串扰问题；2）深度学习模型突破人工定量瓶颈，使高通量药物筛选效率提升20倍；3）发现Y040-7904通过SIRT1/FoxO3a双重调控线粒体更新，为AD治疗提供新靶点。未来通过优化探针pKa值（如靶向线粒体基质pH 8.0）和结合超分辨成像，有望进一步揭示神经元突触区线粒体自噬的空间调控规律。