利用适应性实验室进化揭示nfxB缺陷型铜绿假单胞菌临床株对环丙沙星耐药性的快速衰退机制及其治疗意义

本研究针对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)因nfxB基因缺陷导致MexCD-OprJ外排泵过表达引发的环丙沙星耐药性问题，通过适应性实验室进化(ALE)实验证明：在无抗生素环境中，临床分离株的环丙沙星耐药性可在100代内快速衰退，主要源于mexCD-oprJ操纵子的新发突变而非nfxB回复突变。该发现为通过药物轮换策略重新启用环丙沙星提供了进化理论基础，论文发表于《Nature Communications》。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，其中铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)作为机会性病原体，在囊性纤维化(pwCF)和慢性阻塞性肺病患者中引发难以治愈的持续性感染。环丙沙星作为治疗这类感染的关键氟喹诺酮类药物，其疗效正因细菌耐药性的快速进化而受到严重威胁。特别值得注意的是，临床分离株中nfxB基因的失活突变会导致MexCD-OprJ外排泵的持续过表达，进而产生对环丙沙星的高水平耐药性。然而，这种耐药性是否会在无抗生素选择压力下维持稳定，以及能否通过进化干预策略实现耐药性逆转，一直是未被深入探索的关键科学问题。

来自丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续性研究中心等机构的研究团队在《Nature Communications》发表重要研究成果。研究人员选取8株携带不同nfxB突变的铜绿假单胞菌临床分离株，通过系统的适应性实验室进化(ALE)实验，首次揭示在无抗生素环境中，这些临床株的环丙沙星耐药性可在短短100代内快速衰退至低于临床折点水平。令人振奋的是，这种耐药性衰退主要源于mexCD-oprJ操纵子的新发突变而非预期的nfxB回复突变，且与细菌适应性代价的补偿进化密切相关。该发现不仅为理解细菌耐药性进化规律提供了新视角，更为临床通过合理设计抗生素轮换策略重新启用环丙沙星提供了理论依据。

研究采用的关键技术包括：1)对8株不同克隆类型的nfxB缺陷型临床分离株进行平行适应性实验室进化(ALE)培养；2)使用E-test法测定环丙沙星等6种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)；3)全基因组测序分析进化种群获得的遗传变异；4)生长曲线分析评估细菌相对适应性；5)竞争实验验证补偿突变体的选择优势。所有临床菌株均来自哥本哈根囊性纤维化中心的患者样本。

研究结果部分的重要发现包括：
"Decline of ciprofloxacin resistance in the PA14 isogenic loss-of-function nfxB177 mutant in antibiotic-free environments"：在无抗生素环境中，PA14实验室菌株的nfxB177突变体经15天(约100代)ALE培养后，环丙沙星MIC从2μg/mL降至与野生型相当的0.094μg/mL，同时细菌适应性完全恢复。

"Decline of ciprofloxacin resistance in nfxB defective clinical strains of P. aeruginosa in antibiotic-free environments"：8株临床分离株中，67%的进化种群(43/64)在无抗生素环境下显示环丙沙星MIC显著降低，其中42株降至临床折点(0.5μg/mL)以下，最高降幅达16倍。值得注意的是，不同遗传背景菌株的耐药性衰退程度存在明显差异。

"Decline of ciprofloxacin resistance is due to mutations in the operon encoding the MexCD-OprJ efflux pump"：全基因组测序揭示耐药性衰退主要与mexC、mexD基因及nfxB-mexCD-oprJ间区的新发突变相关，包括点突变和1.4-7.3kb的大片段缺失，而原始nfxB突变均未发生回复。构建的nfxB177mexC双突变体证实mexC突变足以恢复环丙沙星敏感性和细菌适应性。

"Relative fitness of nfxB defective clinical strain populations after ALE in antibiotic-free environments"：适应性分析显示，初始适应性代价最高的临床株76在补偿进化后适应性改善最显著，而初始代价较低的296株虽显示耐药性衰退但适应性未明显提高，表明补偿进化受原始遗传背景的强烈制约。

讨论部分强调，该研究首次系统证明nfxB缺陷型临床株的环丙沙星耐药性具有"进化脆弱性"——在无选择压力下会快速衰退。这一发现具有重要临床意义：1)为设计"用药-休药"的抗生素轮换策略提供分子基础，特别是对nfxB突变主导的耐药感染；2)揭示外排泵编码基因而非调控基因的突变是耐药性衰退的主要途径；3)证实遗传背景通过历史偶然性约束着补偿进化的轨迹。然而，研究者也指出该策略的局限性：在混合耐药突变体的真实感染中，需结合耐药机制诊断来指导精准治疗。这项研究为将进化理论转化为临床抗感染策略提供了范例，开辟了通过操控细菌进化轨迹来延长抗生素使用寿命的新途径。