利用兔诱导多能干细胞高效生成非啮齿类物种种系嵌合体的突破性研究

研究人员针对哺乳动物种系嵌合技术长期局限于小鼠和大鼠的瓶颈问题，通过重编程兔诱导多能干细胞（iPSCs），首次实现了非啮齿类动物的高效种系嵌合。该研究筛选出KLF2、ERAS和PRMT6基因组合，显著提升iPSCs的胚胎定植能力，成功培育出器官贡献率达100%的嵌合体兔，并证实雌性后代可高效传递iPSCs基因组。这一突破为建立复杂遗传性状的兔疾病模型奠定基础，填补了大型哺乳动物多能干细胞应用的空白。

　　

在生物医学研究中，小鼠模型长期占据主导地位，其核心原因在于胚胎干细胞（ESCs）技术的高度成熟——科学家能轻松培育出携带特定基因突变的小鼠。然而，这种"鼠霸权"正面临严峻挑战：人类许多复杂疾病（如心血管疾病、代谢综合征）在小鼠模型中难以真实再现，而兔、猪等更接近人类生理的大型哺乳动物，却因多能干细胞技术不完善而无法广泛应用。这一困境在2013年达到顶峰：当时国际团队尝试用猪、牛iPSCs构建嵌合体，贡献率竟不足0.1%，远达不到种系传递要求。

法国国家农业研究院等机构的研究团队将目光投向兔——这种兼具繁殖周期短（妊娠期仅31天）和生理特征接近人类的理想模型动物。他们发现传统兔iPSCs存在"先天缺陷"：在啮齿类动物有效的2iLIF培养基中，兔细胞会出现自发分化、染色体不稳定等问题。更棘手的是，这些细胞表观遗传状态更接近"始发态"（primed state）而非"初始态"（naive state），导致其胚胎定植能力几乎为零。

研究团队设计了三步破解方案：首先建立双荧光报告系统（DPPA2-mKO2/EOS-tagBFP），通过筛选36个候选基因的cDNA文库，锁定KLF2、ERAS和PRMT6的关键组合。当这三种基因在VALGX培养基（含维生素C、XAV939等）中协同表达时，兔iPSCs的H3K27me3核灶减少69%，CD75^high
亚群比例提升8倍，标志着X染色体再激活和初始态转化。单细胞转录组分析显示，处理组中"初始态标记基因"（如DPPA5、PRDM14）表达量激增20倍，而"始发态基因"（如CER1）下降90%。

胚胎注射实验验证了革命性突破：KLF2/ERAS/PRMT6三基因修饰的CD75^high
细胞注入兔桑椹胚后，100%受体胚胎出现GFP⁺
细胞（对照组仅5%），其中63%胚胎的iPSCs贡献超过20个细胞。更惊人的是，存活至成年的嵌合体兔中，皮肤、心脏等器官的嵌合度达99.8%，卵巢中43/47卵母细胞携带外源基因。通过连接介导PCR鉴定出5个基因组整合位点，证实F1代胚胎100%遗传了iPSCs基因组，种系传递效率远超啮齿类模型。

机制研究发现，三基因协同作用通过双重路径增强嵌合能力：一方面PRMT6通过H3R2me2修饰促进全局DNA去甲基化，ERAS激活AKT通路加速细胞周期；另一方面KLF2-ESRRB轴抑制MAPK/WNT通路（EGFR表达量下降4倍），同时激活氨基酸代谢通路（ALDH7A1上调8倍）。这种代谢重编程使细胞在胚胎微环境中获得竞争优势。

该研究首次实现非啮齿类哺乳动物的高效种系嵌合，其意义远超技术本身：①建立的"可逆KEP表达系统"（Shield1调控）为大型动物基因编辑提供安全开关；②筛选出的CD75^high
亚群可作为全能性干细胞的新标记；③揭示PRMT6在表观遗传重置中的新功能，为诱导多能性提供新靶点。这些突破使兔模型在人类疾病研究、器官再生等领域的应用成为可能，相关成果发表于《Nature Communications》。

关键技术方法包括：①构建含36个人类cDNA的SIV慢病毒文库进行功能筛选；②开发DPPA2-mKO2/EOS-tagBFP双报告系统追踪初始态转化；③采用VALGX培养基（含activin A、XAV939等）优化培养条件；④通过连接介导PCR定位基因组整合位点；⑤对嵌合体进行全器官qPCR分析和三维荧光成像。实验使用新西兰白兔胚胎（E1.5）及成年个体作为受体。

研究结果部分：
"VALGX培养方案引导iPSCs向初始态转化"
通过比较B19_KF与B19_VAL细胞的表观标记，发现VALGX培养基使H3K14ac水平提升3倍，5mC降低60%，但X染色体未完全激活（69%细胞保留H2AK119ub核灶），提示部分重编程。

"cDNA筛选鉴定支持初始态的基因"
从25个候选基因中锁定KLF2/ERAS/PRMT6组合，该组合在二次筛选中使tagBFP⁺
细胞比例达71%，且显著降低H3K27me3核灶（p<0.01）。

"KEP细胞展现增强的胚胎定植能力"
KEPc_VAL细胞注入胚胎后，63%囊胚出现GFP⁺
细胞团（对照KEPc_KF仅23%），且50%胚胎含超过20个SOX2⁺
/GFP⁺
细胞。

"高CD75 KEP细胞产生种系嵌合体"
CD75^high
亚群构建的嵌合体兔中，83%胎儿检出GFP DNA，成年个体皮肤嵌合度达100%。雌性嵌合体与野生型交配后，27个E14胚胎全部携带外源基因。

结论指出，该研究建立的KEP-VALGX体系突破了20年来非啮齿类种系嵌合的技术壁垒，其创新性体现在：①首次在兔实现iPSCs的种系传递；②发现PRMT6通过调控H3R2me2促进表观重置；③证实氨基酸代谢通路重编程是胚胎定植的关键。这些发现为大型动物基因修饰提供了全新范式，将加速人类疾病建模和再生医学研究进程。