冷冻生物样本中SEM充电伪影的消除：交错扫描技术揭示近天然状态下的亚细胞结构

研究人员针对冷冻生物样本在扫描电子显微镜(SEM)成像中因绝缘区域产生的充电伪影问题，开发了交错扫描技术。通过优化电子束时空分布，成功消除了哺乳动物细胞、藻类和鼠脑组织等样本的成像伪影，首次在近天然状态下观察到脂滴周围膜接触位点、轴突髓鞘层等关键亚细胞结构。该成果发表于《Nature Communications》，为冷冻电子显微镜(cryo-EM)体积成像提供了重要技术突破。

　　

在生命科学研究中，冷冻电子显微镜技术已成为观察生物样本近天然状态的重要工具。然而，当这项技术遇到扫描电子显微镜(SEM)时，一个长期存在的技术瓶颈始终困扰着研究人员——绝缘样本在电子束照射下产生的充电伪影。这些伪影如同显微镜图像上的"静电幽灵"，严重扭曲了脂滴(LD)、髓鞘等关键结构的真实形貌，使得科学家们难以准确观察膜接触位点(MCS)、降解区室(DC)等对理解细胞功能至关重要的亚细胞结构。更令人困扰的是，传统的解决方案如降低加速电压或缩短驻留时间，往往以牺牲图像分辨率和信噪比为代价，形成"顾此失彼"的技术困境。

来自英国罗莎琳德·富兰克林研究所等机构的研究团队在《Nature Communications》发表突破性研究，开发出名为"交错扫描"的革命性成像策略。通过重新设计电子束扫描路径，该技术成功消除了冷冻生物样本中的充电伪影，首次在近天然状态下清晰揭示了哺乳动物细胞脂滴周围的内质网(ER)包裹、藻类降解区室的三维网络以及成年鼠脑皮质中不同髓鞘厚度的轴突等精细结构。这项技术突破不仅解决了冷冻SEM成像领域长期存在的技术难题，更为理解细胞器互作、神经髓鞘化等基础生物学过程提供了全新研究工具。

研究团队采用三项关键技术方法：1)开发外部扫描引擎控制的交错扫描模式，实现每两个像素在x/y方向上的跳跃式电子束扫描；2)结合聚焦离子束(FIB)铣削和冷冻固定技术，对RPE-1细胞、眼虫藻(E. gracilis)和高压冷冻(HPF)处理的118天龄小鼠脑组织进行三维体积成像；3)应用Segment Anything模型(SAM)评估不同扫描策略对自动分割的影响。所有样本均在1.2 kV低加速电压、6.3 pA束流条件下成像，通过比较传统光栅扫描与交错扫描的图像质量，系统评估了100-1000 ns不同驻留时间的成像效果。

实验设置部分详细比较了传统光栅扫描与交错扫描的物理原理差异。传统扫描方式如同"犁地式"逐行覆盖，相邻像素的照射间隔仅约100 ns，导致电荷在局部区域快速积累。而交错扫描则采用"跳棋式"策略，在x和y方向均跳过2个像素，使相邻像素的照射间隔延长至约400 ns，为电荷消散争取宝贵时间。这种设计使得电荷能够从照射点向四周均匀扩散，而非形成定向积累。研究团队通过精心设计的实验证明，在52°倾斜角成像条件下，采用100 ns驻留时间配合100次重复的交错扫描方案，获得的图像灰度直方图均值最接近理想值122（8位图像的中间值为127），表明充电伪影得到最佳抑制。

扫描策略对自动分割的影响研究得出了令人振奋的结果。当使用新兴的Segment Anything模型对图像进行自动分析时，交错扫描获得的图像能识别出比传统扫描多50%的生物结构，且分割形状的复杂度评分提高20-40%。这一发现尤为重要，因为它意味着减少充电伪影不仅能提升人工解读的准确性，更能为未来自动化、高通量的冷冻电子显微镜分析铺平道路。在RPE-1细胞的成像中，交错扫描首次清晰揭示了脂滴周围的内质网包裹结构，以及降解区室内部的电子致密物质网络——这些关键特征在传统扫描图像中完全被充电伪影所掩盖。

对眼虫藻(E. gracilis)的成像研究取得了突破性发现。通过1600 μm³
的三维重构，研究人员首次在近天然状态下观察到降解区室(DC)网络的精细结构。定量分析显示，26个DC囊泡可明显分为四个功能亚群，其中小体积(<1 μm³
)DC中有半数含有20%以上的致密内容物，暗示它们可能处于不同的发育阶段。更引人注目的是，研究人员发现了DC与叶绿体、线粒体等细胞器间的膜接触证据，这些接触部位的膜变形特征强烈提示存在结构特化的膜接触位点(MCS)。这些发现为理解单细胞生物的消化系统运作机制提供了全新视角。

在成年鼠脑皮质研究中，交错扫描技术克服了髓鞘高脂含量带来的严重充电问题，首次在非变性条件下观察到不同髓鞘厚度的轴突群体。定量测量揭示，薄髓鞘轴突(19±4 nm)和厚髓鞘轴突(40±11 nm)采用截然不同的髓鞘形成策略：薄髓鞘轴突内存在广泛的细胞质通道网络(1.6±1.3 μm³
)，而厚髓鞘轴突则通过少突胶质细胞舌部的持续添加来维持髓鞘结构。更令人惊讶的是，研究人员还观察到一个微胶质细胞同时与三个不同轴突形成广泛接触的现象，这为理解中枢神经系统(CNS)的免疫监视机制提供了新的形态学证据。

研究结论部分强调，这项技术突破的核心价值在于其普适性。通过对哺乳动物细胞、单细胞藻类和复杂神经组织等不同样本的成功成像，证明交错扫描策略能够适应各种生物样本的导电性差异。与传统的染色、包埋方法相比，这种冷冻电子显微镜技术最大程度保留了样本的原始状态，为观察膜脂分布、细胞器互作等精细结构提供了前所未有的清晰度。特别值得注意的是，该技术不需要对现有电镜硬件进行改造，仅通过扫描路径的重新设计即可实现，这使得它具备广泛的推广应用价值。

讨论部分深入分析了技术的优化空间和发展前景。虽然跳过2个像素的交错模式在多数情况下表现优异，但在某些高电荷积累区域（如脂滴周围）仍能观察到轻微的光晕效应。研究人员推测，针对特定样本可能需要优化跳跃步长——高放大成像需要更大的像素跳跃来保持相同的电荷消散距离。未来的研究可能会结合蒙特卡洛模拟，建立考虑样品电阻率和表面积的电荷重分布模型，实现扫描模式的"个性化定制"。此外，与气体注入电荷补偿等技术相结合，可能进一步拓展该技术在更低加速电压条件下的应用潜力。

这项由Abner Velazco、Thomas Glen和Maud Dumoux等研究人员完成的工作，不仅解决了冷冻SEM成像领域长期存在的技术瓶颈，更重要的是为生命科学研究打开了一扇新窗口。通过消除充电伪影的干扰，科学家们终于能够"看清"那些隐藏在静电噪声下的亚细胞景观，为理解细胞器互作、神经髓鞘形成等基本生物学过程提供了全新的研究工具。正如研究者所言，这项技术突破将显著推动冷冻电子显微镜在结构生物学、细胞生物学和神经科学等领域的应用，助力科学家们揭开生命微观世界的更多奥秘。