肿瘤靶向AAV9递送IL-12增强卵巢癌异种移植模型抗肿瘤免疫与安全性研究

这篇研究创新性地开发了基于肿瘤趋向性AAV9（tAAV9）的基因疗法，通过Spy-ligation技术将抗叶酸受体1（anti-FOLR1）抗体片段与AAV9偶联，实现白介素12（IL-12）在肿瘤微环境（TME）的特异性递送。相比野生型AAV9（rAAV9），tAAV9-IL-12显著抑制肿瘤进展，并通过负反馈调节血清IL-12水平降低肝毒性和细胞因子释放综合征（CRS）风险，为癌症免疫治疗提供了新策略。

　　

Abstract
白介素12（IL-12）作为促炎细胞因子在癌症免疫治疗中潜力巨大，但其血清半衰期短和全身毒性限制了临床应用。研究团队通过Spy-ligation技术将抗FOLR1抗体片段与AAV9偶联，构建了肿瘤靶向载体tAAV9，实现IL-12在叶酸受体α（FOLR1）阳性肿瘤微环境（TME）的特异性表达。在hFOLR1-MC38卵巢癌异种移植模型中，静脉注射tAAV9-IL-12显著抑制肿瘤生长，中剂量组（2E13 vg/kg）实现100%三个月存活率，且血清IL-12水平随肿瘤消退自然下降，形成安全性负反馈机制。

Facile and high-yield production of tAAV9
tAAV9通过SpyCatcher003修饰的AAV9衣壳蛋白（VP1-453位点）与SpyTag融合的抗FOLR1单链抗体（scFv）高效偶联。Western blot显示VP1/VP2比例保持1:1，偶联效率达90%以上。相较于传统AAV2，AAV9的系统递送效率提升10倍，且批次间稳定性优异。

tAAV9特异性感染机制
体外实验显示，tAAV9-GFP在FOLR1+细胞系（hFOLR1-MC38、SKOV-3）中的转导效率较rAAV9提高10倍，而在FOLR1-细胞（野生型MC38、HepaRG）中降低2倍。活体成像证实tAAV9-luciferase在NOG小鼠肿瘤区域富集，肝脏信号强度较rAAV9降低40%，基因组拷贝数分析显示肿瘤组织特异性感染。

TME特异性IL-12的抗肿瘤效应
hFOLR1-MC38荷瘤小鼠模型中，tAAV9-IL-12中剂量组（2E13 vg/kg）肿瘤体积缩小78%，免疫荧光显示TME中CD8⁺
T细胞和NK细胞浸润增加3倍。值得注意的是，高剂量rAAV9-IL-12组因血清IL-12水平飙升至358 ng/mL引发致死性CRS，而tAAV9组C_max
仅1.59 ng/mL。

安全性优势与负反馈机制
血液生化检测显示rAAV9-IL-12组ALT和总胆红素（TBIL）水平异常升高，脾脏重量增加2-3倍，而tAAV9组无显著毒性。肝组织H&E染色揭示rAAV9组存在明显炎性细胞浸润。当肿瘤被抑制后，tAAV9感染的"IL-12供体细胞"被免疫系统清除，导致血清IL-12水平自发下降，形成独特的安全性闭环。

Discussion
该研究突破传统抗体-IL-12融合蛋白疗效不足（临床ORR<8%）和CAR-T分泌IL-12的不可控毒性（3-4级不良反应）两大瓶颈。通过VP1-453位点特异性修饰平衡AAV9生产效率与靶向性，其EC50较单抗体片段提升5倍。未来可通过瘤内注射进一步降低脱靶风险，为实体瘤免疫治疗提供新范式。

Materials and methods
关键技术包括：1）四质粒共转染生产scAAV；2）CHO-S细胞表达SpyTag-scFv；3）碘克沙醇梯度离心纯化；4）多色免疫荧光（CD3/CD8/NK1.1五重染色）分析TME免疫细胞动态。动物实验通过AAALAC认证，遵循ISM-IACUC-0152-R等伦理批件。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持结论，专业术语如EC50、ORR等均保留原文表述形式。）