靶向帕金森病相关LRRK2的II型激酶抑制剂开发及其构象特异性调控机制研究

本研究针对帕金森病(PD)关键靶点LRRK2激酶活性异常问题，通过组合化学策略首次设计出选择性II型抑制剂RN277和RN341。通过冷冻电镜(cryo-EM)结构解析和功能验证，证实其通过稳定"DYG-out"构象特异性抑制LRRK2/LRRK1，且不诱导S935位点去磷酸化，为PD治疗提供了新型工具化合物和潜在疗法。

　　

帕金森病(PD)作为全球影响超600万人的神经退行性疾病，其发病机制与富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)的异常激活密切相关。虽然已有MLi-2等I型抑制剂进入临床试验，但所有现有化合物均靶向激酶活性构象，可能引发肺组织病理变化等副作用。更关键的是，I型与II型抑制剂对LRRK2构象调控的生物学差异尚未阐明，这严重制约了靶向治疗的发展。

为突破这一瓶颈，研究人员创新性地采用组合化学策略，将选择性LRRK2 I型抑制剂(如MLi-2、PF-360)的铰链结合模块与广谱II型抑制剂(如GZD-824、Rebastinib)的DYG-out结合基团进行分子杂交。通过迭代合成循环结合结构生物学验证，最终获得首个LRRK2特异性II型抑制剂RN277和RN341。该成果发表于《SCIENCE ADVANCES》，不仅填补了工具化合物的空白，更揭示了构象特异性抑制的分子机制。

研究主要运用了以下关键技术：1) 基于差示扫描荧光法(DSF)的激酶结合筛选；2) 冷冻电镜解析LRRK2^RCKW
-抑制剂复合物结构(分辨率3.3?)；3) 体外激酶活性检测(PhosphoSense和质谱法)；4) 细胞水平Rab8a/pS72磷酸化分析；5) 单分子全内反射荧光(TIRF)微管运动实验。

【化合物设计合成与评价】
通过三阶段优化：首先基于MLi-2骨架的杂交化合物虽显示亚微摩尔级抑制(IC₅₀
=185 nM)，但选择性欠佳。转而采用PF-360的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶铰链结合模块，获得先导化合物RN222(IC₅₀
=134 nM)。最终引入Rebastinib骨架并优化2位取代基，开发出RN277(IC₅₀
=135 nM)和RN341(IC₅₀
=296 nM)，其选择性显著提升，仅稳定10%筛选激酶。

【RN277的II型抑制机制】
冷冻电镜结构显示RN277结合使LRRK2激酶域呈现典型II型特征：DYG基序外翻、R-spine断裂、激活环无序。与GZD-824复合物相比，K1906-E1920盐桥距离增至5.1?，且G-rich环柔性增加，揭示了新型结合模式。

【激酶选择性谱】
RN341在350激酶筛选中仅抑制4个主要脱靶激酶(STK10、MAPK14等)，EC₅₀

1.5μM。值得注意的是，其对LRRK1同样有效，能剂量依赖性抑制Rab7磷酸化(pS72)，证实了LRRK亚家族特异性。

【细胞与功能验证】
在293T细胞中，RN277/RN341可抑制野生型和G2019S突变型LRRK2介导的Rab8a磷酸化(pT72)，且不引起S935去磷酸化——这与I型抑制剂形成鲜明对比。体外实验证实，10μM RN277/RN341能完全挽救LRRK2^RCKW
导致的驱动蛋白运动阻滞，这种"构象特异性救援"效应通过稳定开放构象实现。

这项研究开创性地开发出LRRK2特异性II型抑制剂工具包，其重要意义体现在三方面：首先，RN277/RN341为首个能区分LRRK2活性与非活性构象的化学探针，为阐明构象依赖性功能调控提供利器；其次，冷冻电镜揭示的新型结合模式为优化抑制剂选择性指明方向；最后，不诱导S935去磷酸化的特性可能规避I型抑制剂的肺部副作用，为PD治疗提供更安全策略。这些发现不仅拓展了LRRK2靶向治疗的选择空间，更为理解激酶构象与神经退行性疾病的关系提供了范式。