酶法合成人乳寡糖类似物及其益生特性的研究

本研究针对人乳寡糖（HMOs）合成成本高、酶特异性限制等问题，利用糖苷水解酶家族94（GH94）的纤维糊精磷酸化酶（CDP），通过定点突变技术成功合成了模拟HMOs核心结构的β-D-Gal-(1,4)-β-D-Glc-(1,4)-D-Glc三糖，产量达40 mg（收率66%）。该类似物显著促进益生菌（如长双歧杆菌）生长，为低成本HMOs工业化生产及肠道微生态调控提供了新策略。

　　

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论文解读

母乳中的人乳寡糖（Human Milk Oligosaccharides, HMOs）是婴儿健康发育的关键成分，不仅能抑制病原体生长，还能促进双歧杆菌（Bifidobacterium）等益生菌定植。然而，HMOs结构复杂，化学合成成本高昂，而酶法合成又面临糖核苷酸供体昂贵、糖基转移酶（GTs）底物特异性严格等问题。糖苷磷酸化酶（GPs）因其可利用廉价的糖-1-磷酸供体，成为潜在替代方案，但其对非天然供体（如半乳糖-1-磷酸，Gal-1-P）的催化机制尚不明确。

为解决这一难题，国内某研究机构团队以GH94家族的纤维糊精磷酸化酶（Cellodextrin Phosphorylase, CDP）为研究对象，通过理性设计和定点突变技术，解析了其催化Gal-1-P合成HMOs类似物的分子机制，并评估了产物的益生功能。研究发表于《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》，为HMOs的工业化生产提供了新思路。

关键技术方法
研究采用PyMOL建模筛选CDP的磷酸结合关键残基（R486、H817、S889、G890），通过Q5?定点突变试剂盒构建丙氨酸突变体；利用E. coli Rosetta
表达系统纯化His₆
-标签蛋白；通过酶动力学分析比较突变体活性；以Gal-1-P为供体、纤维二糖为受体合成三糖，经HPLC纯化后，通过质谱和核磁共振表征结构；最后评估三糖对Bifidobacterium longum
等益生菌的促生长作用。

研究结果

1. 定点突变与蛋白纯化
通过丙氨酸扫描发现，R486A和G890A突变导致CDP完全失活，而H817A和S889A活性分别降低2倍和5倍，证实R486与G890是维持酶活性的关键残基，其通过氢键和盐桥稳定糖-1-磷酸的磷酸基团。

2. 三糖合成与表征
野生型CDP以Gal-1-P为供体，成功合成β-D-Gal-(1,4)-β-D-Glc-(1,4)-D-Glc三糖，产量40 mg（66%收率），结构经质谱和核磁验证。该产物模拟了HMOs的核心骨架乳糖-N-三糖II（LNT II）。

3. 益生功能验证
合成的三糖显著促进B. longum
JCM 1217、Roseburia faecis
JCM 31261和Blautia producta
JCM 1471的生长，证实其具有与天然HMOs相似的益生特性。

结论与意义
本研究首次阐明CDP关键残基对Gal-1-P识别的分子机制，突破传统GTs合成HMOs的成本瓶颈，为廉价寡糖的酶法设计提供模板。合成的三糖不仅结构类似天然HMOs，还具有明确的益生功能，未来可应用于婴幼儿配方奶粉或功能性食品。此外，该策略可拓展至其他糖-1-磷酸供体，为多样化HMOs类似物库的构建奠定基础。