定向进化超稳定碳酸酐酶DvCA8.0增强其对烟气杂质的耐受性及其在碳捕集中的应用

为解决工业烟气中SO4 2- 、NO3 - 等杂质抑制碳酸酐酶（CA）活性的问题，研究人员通过易错PCR构建DvCA8.0突变体文库，开发高通量筛选体系，获得耐受性提升50%的突变体E12（G7D）。该研究首次实现CA对烟气杂质的定向进化，为碳捕集利用与封存（CCUS）技术中酶稳定性难题提供解决方案。

　　

随着全球气候变化加剧，碳捕集利用与封存（CCUS）技术成为减少工业点源CO₂
排放的关键手段。然而，工业烟气中的SO_x
和NO_x
杂质会转化为SO₄
^2-
、NO₃
^-
等抑制性离子，显著降低碳酸酐酶（CA）在吸收剂中的催化效率。尽管已有耐高温CA变体的开发，但针对烟气杂质的酶稳定性改造仍是空白。

欧洲某研究团队在《Computational and Structural Biotechnology Journal》发表研究，以超稳定CA变体DvCA8.0为起点，通过易错PCR构建约1000个突变体的文库，开发了结合固液两相筛选的高通量平台。关键技术包括：1）基于KHCO₃
-酚酞的显色法初筛；2）80℃热裂解同步筛选热稳定性；3）混合抑制剂（422 mM SO₄
^2-
+134.5 mM NO₃
^-
等）耐受性评估；4）分子动力学模拟解析突变效应。

3.1 突变体文库构建
通过NdeI/XhoI酶切将突变基因克隆至pET22b(+)载体，转化E. coli BL21(DE3)，获得约700 bp插入片段的阳性克隆。

3.2 筛选条件优化
建立"冻融-滤膜转移"固相显色法（图1），可在10分钟内通过粉红色晕圈鉴定活性克隆；液相筛选采用ZYP-5052自诱导培养基，80℃热裂解消除宿主酶背景，使DvCA8.0活性保留率达野生型的3倍（图2）。

3.3 高通量筛选
初筛481个活性突变体（50.1%），次筛86个耐受12.5%抑制剂混合液的变体。规模放大验证显示，突变体E12在300-600 mM抑制剂中活性提升50-65%（表1），其单点突变G7D远离催化中心（Cys55等）和别构位点（Ile52等），平均距离超过20?（表6）。

3.5 动力学参数测定
Wilbur-Anderson法证实E12的抑制常数K_i
达245 mM，较DvCA8.0（151 mM）提升38%。Lineweaver-Burk分析显示混合型抑制模式，突变体V_max
^app
降幅更小（66% vs 73%）（图4，表2）。

3.7 分子模拟机制解析
同源建模预测E12表面负电荷区域扩大（2589?²
→4268?²
），通过电荷排斥减少阴离子抑制剂结合（图6）。分子动力学模拟发现Asp7形成额外氢键，但催化腔体积缩小导致k_cat
降低（图7-8），解释了其"高稳定-低活性"特性。

该研究首次实现CA对工业烟气杂质的定向进化，突破传统仅关注热稳定性的局限。突变体E12在模拟烟气环境中展现显著优势，其表面电荷修饰策略为工业酶改造提供新思路。建立的"热稳定性-化学耐受性"双维度筛选体系，可加速CCUS领域其他关键酶的优化进程。未来通过组合突变或理性设计，有望进一步平衡酶活与稳定性，推动生物催化在碳中和中的应用。