综述：原位冷冻电镜和断层扫描技术在细胞及生物样本中的应用

这篇综述系统阐述了冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术的突破性进展，重点介绍了其在近天然状态下解析细胞和生物体超微结构的能力。文章详述了从样本制备（如高压冷冻、FIB铣削）、靶向定位（cryo-CLEM）到高分辨率成像（SPA与STA）的全流程创新，并展示了该技术在病毒入侵、神经退行性疾病、CO2 固定等领域的应用，同时指出AI和自动化将推动未来发展。

　　

引言

冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）已成为结构生物学领域的革命性工具。通过“分辨率革命”，cryo-EM可解析孤立生物分子的原子级结构，而cryo-ET则能揭示细胞和组织内部的天然三维架构。聚焦离子束（FIB）铣削技术的引入，使得厚样本的薄层制备成为可能，而关联光镜-电镜（CLEM）技术将荧光定位与高分辨率成像结合，进一步拓展了研究维度。

细胞及生物样本的制备方法

样本冷冻技术
快速冷冻是保留生物结构近天然状态的关键。对于厚度小于10 μm的样本， plunge freezing是首选；而高压冷冻（HPF）则适用于更厚的组织样本。冷冻保护剂的使用可减少冰晶损伤，但超过500 nm的样本区域仍需减薄以实现电子透明。

样本减薄技术
传统冷冻切片（CEMOVIS）存在压缩伪影问题，而FIB铣削能制备300 nm以下的薄层。新兴的等离子离子源和自动化流程有望提升效率。混合策略如“切片-FIB联用”正成为新趋势，例如通过预切片降低铣削难度。

靶向定位技术
cryo-CLEM通过荧光标记引导目标区域的选择，但分辨率受限。超分辨技术（如STED、PALM）的低温适配提升了定位精度，而集成化设备（如FIB腔内荧光成像）减少了样本转移风险。

成像策略与数据分析

cryo-EM与cryo-ET的差异
cryo-EM通过单颗粒分析（SPA）获得高分辨率重构，而cryo-ET通过倾斜系列重建三维断层图像，保留空间背景但分辨率较低。混合策略如“单颗粒断层扫描”结合两者优势，利用高剂量正投影提升信噪比。

人工智能的赋能
深度学习在去噪、分类和分割中表现突出。例如，SPACE tomo工具实现了自动化断层扫描分析，而标注数据库的建立为视觉蛋白质组学奠定基础。

应用突破

亚细胞架构解析
cryo-ET揭示了HIV-1病毒核输入过程中核孔复合体（NPC）的精细相互作用，以及热休克下大肠杆菌中GroEL-GroES₁
/₂
的构象变化。在神经科学中，阿尔茨海默病脑组织的β-淀粉样蛋白原纤维结构被首次原位解析。

原位大分子结构
核糖体在抗生素压力下的碰撞状态、心脏肌丝中myosin的排列规律，以及蓝藻羧酶体（α/β-carboxysome）内Rubisco的空间组织，均通过STA技术得以阐明。病毒学领域，SARS-CoV-2刺突蛋白的膜上动态和埃博病毒核衣壳组装机制成为研究热点。

挑战与展望

样本异质性和低信噪比仍是主要瓶颈。未来，AI驱动的实时靶向、冷冻-体积电镜联用（volume EM）和自动化流程将推动技术普及。正如作者所言：“我们正站在高分辨率细胞图谱时代的门槛上。”