多粘菌素B联合阿米卡星通过调控NlpE表达延缓肺炎克雷伯菌耐药性的机制研究

为解决临床多药耐药肺炎克雷伯菌（MDR-Kp）对多粘菌素B（PMB）耐药性快速上升的难题，重庆医科大学附属第二医院团队通过基因敲除、qRT-PCR和生物膜分析等技术，首次揭示PMB联合阿米卡星（AMK）可显著延缓耐药性发展，并发现NlpE-Cpx-AcrAB信号通路及生物膜形成的关键调控作用，为临床联合用药策略提供新依据。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，其中碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的流行尤为棘手。多粘菌素B（PMB）作为治疗CRKP感染的"最后防线"药物，其耐药率在亚洲、欧洲部分地区持续攀升。更令人担忧的是，亚抑菌浓度的PMB暴露会加速细菌耐药性演化，同时促进生物膜形成，形成恶性循环。尽管PMB与阿米卡星（AMK）联用已显示出协同抗菌效应，但其能否延缓耐药性发展尚不明确。

重庆医科大学附属第二医院的研究团队在《Infection, Genetics and Evolution》发表的研究中，通过连续诱导耐药实验发现：单用1/2 MIC PMB时，肺炎克雷伯菌1-2天即产生耐药，而PMB+AMK联用可将耐药出现时间推迟至第7天。通过构建nlpE和cpxR基因敲除株及回补株，结合qRT-PCR和激光共聚焦显微镜等技术，首次揭示NlpE通过调控CpxA/R双组分系统和AcrAB外排泵表达，同时增强生物膜形成能力，从而促进PMB耐药。而AMK的加入能显著抑制这些基因表达和生物膜形成，实现耐药延迟。

关键技术方法
研究选取3株临床分离的肺炎克雷伯菌（含CRKP株Kp81），采用微量肉汤稀释法测定MIC，建立体外连续诱导模型。通过同源重组构建nlpE/cpxR敲除株及回补株，利用qRT-PCR分析phoP、acrA等耐药相关基因表达差异，结合结晶紫染色和透射电镜观察生物膜及形态变化。

研究结果

3.1 PMB联合AMK延缓耐药性发展
连续诱导实验显示，单用PMB时所有菌株1-2天内MIC升至耐药水平（>2 μg/mL），而PMB+AMK联用使Kp81株耐药出现延迟至第7天。

3.2 基因表达谱特征
耐药株Kp81·R中phoP、nlpE、cpxR和acrA表达显著上调（p<0.01），而延迟耐药株Kp81·DR中这些基因被抑制。PMB处理20小时后，nlpE敲除株中nlpE表达反常升高，提示负反馈调节机制。

3.3 基因敲除验证功能
nlpE敲除使耐药出现延迟5天（第6天才耐药），cpxR敲除延迟至第4天。回补株耐药时间介于野生型与敲除株之间，证实基因剂量效应。

3.4 生物膜的关键作用
PMB耐药株生物膜量较野生型增加3倍（p<0.001），而联用AMK组显著低于单药组。nlpE敲除株生物膜形成能力减弱，经PMB诱导后仍低于野生型。

结论与意义
该研究首次阐明PMB通过激活NlpE-Cpx-AcrAB通路促进肺炎克雷伯菌耐药的双重机制：既调控外膜修饰基因phoP，又增强AcrAB外排泵活性和生物膜形成。而AMK能阻断这一通路，使联合用药成为延缓耐药的有效策略。这一发现不仅为临床CRKP治疗提供新方案，更揭示NlpE作为耐药调控新靶点的潜力。未来可针对该通路开发小分子抑制剂，与现有抗生素联用以延长药物生命周期。

（注：全文数据均来自原文实验结果，未添加外部信息；专业术语如MIC（最小抑菌浓度）、CRKP（碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌）等均按原文格式标注；作者单位采用中文名称；技术方法部分省略具体质粒构建步骤但保留关键实验设计）