利用V型CRISPR-AsCas12a系统实现人类线粒体DNA靶向缺失编辑

为解决线粒体DNA（mtDNA）突变导致的神经肌肉疾病缺乏有效编辑工具的难题，法国斯特拉斯堡大学团队通过优化AsCas12a核酸酶的线粒体靶向递送，首次实现人类mtDNA的精准缺失编辑。研究证实Neurospora crassa来源的Su9靶向序列可高效引导AsCas12a进入线粒体基质，双crRNA编程系统成功诱导mtDNA特异性缺失，经NGS验证缺失边界精确连接。该成果为建立线粒体疾病模型和基因治疗提供新工具，发表于《NAR Molecular Medicine》。

　　

线粒体作为细胞的能量工厂，其基因组（mtDNA）突变与数百种疾病相关，从肌肉萎缩到早发型阿尔茨海默病，全球约每5000人中就有1例患者。这些疾病的严重程度往往取决于突变mtDNA与正常mtDNA的混合比例（异质性），但现有技术难以精准操控mtDNA。传统CRISPR系统因向导RNA难以进入线粒体而失效，而锌指核酸酶（mito-ZFNs）等工具又面临设计复杂、递送困难的瓶颈。更棘手的是，线粒体缺乏完整的DNA修复机制，双链断裂（DSB）通常导致mtDNA降解而非修复——这既是挑战，也可能成为编辑突破口。

法国斯特拉斯堡大学Natalia Nikitchina团队在《NAR Molecular Medicine》发表的研究取得了关键突破。研究人员另辟蹊径，选择V型CRISPR-AsCas12a系统：其crRNA长度仅40-44nt（相比Cas9的100nt更易线粒体导入），且能产生粘性末端（sticky ends），为mtDNA断裂后的重连创造条件。通过构建稳定表达Su9-AsCas12a的HEK-293 T-REx细胞系，结合MGME1 exonuclease（线粒体DNA降解关键酶）的siRNA抑制，首次实现人类mtDNA的定向大片段缺失编辑。

关键技术包括：（1）四种MTS（线粒体靶向序列）的预测筛选与功能验证；（2）tetracycline诱导型稳定细胞系构建；（3）submitochondrial fractionation（亚线粒体分级）定位AsCas12a；（4）linker-mediated PCR（LM-PCR）检测DSB末端；（5）NGS分析缺失边界。样本来源于实验室培养的HEK-293及其衍生细胞系。

Su9-AsCas12a的线粒体精准定位
通过计算分析COX8A、Su9等MTS的等电点（pI）和亲水性（GRAVY），预测Su9最具潜力。实验证实Su9-AsCas12a能抵抗proteinase K对线粒体外膜的消化（与基质蛋白uL4m行为一致），而外膜蛋白TOMM20被完全降解。免疫荧光显示>90%的FLAG标记信号与线粒体标志物TOMM20共定位，且线粒体网络形态未受影响。

呼吸功能与基因组稳定性验证
OCR（氧消耗速率）检测发现，稳定细胞系的基线呼吸率降低源于mtDNA自然变异（A8566C导致ATP6/8氨基酸替换），而非AsCas12a表达。Western blot显示线粒体编码蛋白COX1、核编码蛋白VDAC1水平稳定，自噬标志物PINK1/Beclin 1无变化，排除线粒体自噬（mitophagy）干扰。

双crRNA诱导大片段缺失
针对ND4（crRNA-1）和ATP6（crRNA-2）设计互补粘性末端的crRNA，在MGME1抑制条件下：

• LM-PCR检测到特异性断裂末端（图4b-c）
• 长片段PCR扩增出预期0.2kb产物（野生型为2.5kb）
• NGS显示8624-10928bp区域完全缺失，边界处存在A8623T变异（30%频率），符合AsCas12a切割位点天然波动
• 延伸实验成功获得7kb缺失（8624-15738bp）

突破性结论与意义
该研究首次提供CRISPR系统编辑人类mtDNA的直接证据：

1. 解决RNA递送难题：Su9-MTS实现151.2kDa大蛋白的线粒体导入，短crRNA突破转运限制
2. 创新编辑策略：利用粘性末端促进断裂mtDNA重连，而非依赖易错的MMEJ（微同源介导末端连接）
3. 建立标准化流程：从MTS优化、MGME1调控到NGS验证，为后续研究提供范本

尽管编辑效率仍需提升（缺失mtDNA占比<5%），但这项工作为模拟Kearns-Sayre综合征等缺失相关疾病奠定基础。未来通过crRNA化学修饰、T4 DNA连接酶共表达等优化，有望发展出治疗性编辑方案，填补线粒体基因治疗空白。