甲基化-CODEC技术实现DNA突变与甲基化的同步双链测序：突破癌症精准医学的新工具

《Nucleic Acids Research》：Methyl-CODEC enables simultaneous methylation and duplex sequencing

研究人员针对DNA突变与甲基化协同致病但现有检测技术无法兼顾高精度与高通量的难题，开发了Methyl-CODEC技术。该技术通过转化抗性dCTP保护反义链，结合酶促转化实现单次测序同时获得双链突变信息(Q30精度)和单碱基甲基化数据(r=0.84 vs EM-seq)，成功区分C>T突变与未甲基化C转化，为癌症早筛和液体活检提供了新方案。

在生命科学领域，DNA的遗传突变与表观遗传修饰如同交响乐中的双重旋律，共同调控着细胞命运。其中，胞嘧啶甲基化(5mC)作为最重要的表观遗传标记，与C>T突变在癌症发生中常呈现协同效应。然而现有技术面临两难困境：双链测序(duplex sequencing)虽能实现超低频突变检测(误差率<10^-6
)，却无法获取甲基化信息；而全基因组甲基化测序(WGBS)或酶转化测序(EM-seq)又需依赖"三字母"基因组比对，导致约28.9%的读段错配，且无法区分真正的C>T突变与人工转化产生的T碱基。更棘手的是，人类基因组中约59万CpG位点存在C>T/G>A种系突变，这使得传统方法会将这些位点错误判定为未甲基化区域。

为突破这一技术瓶颈，来自博德研究所和丹娜法伯癌症研究院的Ruolin Liu、Farzaneh Darbeheshti等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表了创新性解决方案——Methyl-CODEC。该技术巧妙地将CODEC(串联原始校正)策略与转化抗性dCTP类似物相结合：首先使用含羟甲基-dCTP的Phi29聚合酶进行链置换延伸，保护反义链免受后续APOBEC酶转化；再通过NEBNext甲基转化模块处理，最终产生两种产物——一条链保留原始序列用于突变检测，互补链携带转化信号指示甲基化状态。这种设计使得单次测序即可同时实现双链验证的突变检测(Q60精度)和单碱基分辨率甲基化分析，且比EM-seq节省47%的比对错误。

关键技术包括：(1)使用四种转化抗性dCTP类似物(5m-dCTP/羧基-dCTP/羟甲基-dCTP/炔丙氨基-dCTP)优化保护效率；(2)基于BWA-MEM/SW的双序列比对算法，允许C/T错配但不惩罚G/A错配；(3)利用UMI标记进行PCR去重；(4)采用NA12878和HCT116 DKO细胞系验证技术性能，后者包含已知的59万种系突变位点。

甲基化检测性能验证
在NA12878细胞系中，Methyl-CODEC与EM-seq的CpG岛甲基化水平呈现0.99的Pearson相关性，且GC偏好性曲线高度一致。特别值得注意的是，在HCT116甲基化对照样本中，传统EM-seq在种系突变位点的甲基化检出率仅31.6%，而Methyl-CODEC保持97.4%的准确率，证明其能有效区分真实突变与人工转化。

双链测序精度保持
尽管引入甲基化检测模块，Methyl-CODEC仍保持duplex sequencing级别的灵敏度。在25×测序深度下，非C>T突变的检测误差率维持在10^-6
-10^-7
范围。对于C>T突变，通过检测互补链的G>A变化仍可实现双链验证，而羟甲基-dCTP的使用将残余C>T错误率控制在10^-3
(Illumina本底误差水平)。

突变-甲基化关联发现
该研究首次在全基因组尺度发现：82%新生5mC突变集中于新形成的CpG二核苷酸，其中T>5mC和A>5mC的CpG偏好性达100%，而G>5mC仅48.6%位于CpG位点。这些突变产生的甲基化CpG中，相邻CpG位点的甲基化水平与基因组背景无显著差异，暗示局部甲基化状态的独立性。

这项研究的突破性在于首次实现单读长双链测序与单碱基甲基化的同步检测，解决了表观遗传与遗传变异协同分析的世纪难题。其创新性体现在：(1)转化抗性接头设计避免UMI在酶转化中降解；(2)羟甲基-dCTP相比5m-dCTP将保护效率提升2个数量级；(3)双链信息互补机制使47%的DNA分子仅需单次测序即可完成双链验证。这些优势使其在液体活检领域展现出巨大潜力——既能通过双链测序捕捉<0.1%的循环肿瘤DNA(ctDNA)突变，又能通过甲基化特征追踪肿瘤组织起源，为癌症早筛和不明原发灶肿瘤的诊断提供全新工具。未来通过整合5hmC检测模块和靶向富集策略，该技术有望在产前诊断、移植监测和衰老研究等领域产生更广泛影响。