SARS-CoV-2聚合酶后组装构象变化激活机制揭示病毒复制新靶点

为解决冠状病毒复制转录复合体(RTC)激活机制不明的关键问题，荷兰阿姆斯特丹自由大学团队通过单分子磁镊技术揭示SARS-CoV-2核心RTC需经历数百秒的构象变化才能获得延伸能力。研究发现RNA模板可加速该过程，而nsp7/nsp8共因子对构象稳定至关重要，为靶向病毒复制早期阶段的抗病毒药物设计提供了新思路。

　　

冠状病毒的复制机器一直是抗病毒研究的主战场。SARS-CoV-2作为引发COVID-19大流行的元凶，其庞大的30kb RNA基因组需要由病毒编码的16个非结构蛋白(nsps)组成的复制转录复合体(RTC)来完成复制。虽然核心RTC（由1个nsp12 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、2个nsp8和1个nsp7组成）已被证明是病毒RNA合成的核心引擎，但令人困惑的是，体外实验显示其需要数分钟才能启动RNA合成，而实际上它却是目前已知最快的RNA聚合酶之一（延伸速率高达180 nt/s）。这个矛盾现象暗示着核心RTC的激活可能存在未知的限速步骤。

荷兰阿姆斯特丹自由大学联合德国埃尔朗根-纽伦堡大学、美国威斯康星大学等国际团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，首次揭示了SARS-CoV-2核心RTC必须经历一个后组装的构象变化才能获得延伸能力的关键机制。研究人员通过高精度单分子磁镊技术，结合动力学建模，发现核心RTC在RNA模板上的激活需要数百秒完成构象重排，而这一过程在无RNA环境下甚至需要数小时。

研究主要运用了三种关键技术：1）单分子磁镊实时追踪技术，通过1043 nt RNA发夹结构监测ssRNA到dsRNA的转换；2）多系统重组蛋白表达（E.coli和Sf9细胞分别表达nsp12-RdRp）；3）共翻译纯化技术获得预组装的"pull-down"核心RTC复合体。

核心RTC的缓慢激活不源于组装或RNA结合
通过系统改变nsp7、nsp8和nsp12的浓度，发现即使在饱和浓度下（nsp12≥0.2μM，nsp7/nsp8≥1.8μM），重组核心RTC仍需要约1000秒激活（图2A-D）。而预组装的pull-down核心RTC仅需秒级激活（图1E），且饱和浓度低两个数量级（图2E），证明传统认为的"组装耗时"假说不成立。

RNA模板驱动的构象重排
最关键的发现来自预孵育实验：当nsps与RNA共孵育10分钟时，82%-95%的核心RTC能在加入NTP后立即启动延伸（图3B），而溶液预孵育需要4.5小时才能达到类似效果（图3A）。这种RNA依赖的加速效应表明，模板RNA能显著稳定延伸能力构象。

nsp7/nsp8的协同调控机制
精妙的顺序组装实验揭示，nsp12单独结合RNA后若缺乏任一辅助因子（nsp7或nsp8），会陷入"构象陷阱"——nsp7缺失时激活延迟超1小时（补充图S4A），而nsp8缺失则完全阻断激活（补充图S4B）。这证明两种辅助因子协同引导nsp12形成正确构象。

延伸动力学与激活机制解耦
值得注意的是，无论采用何种表达系统（E.coli或Sf9），或改变辅助因子浓度，延伸阶段的动力学参数（△t_E
、△L_E
及暂停分布）均保持一致（图4），证实激活阶段的构象变化独立于延伸机制。

nsp13解旋酶的调控作用
在模拟完整RTC的实验中，加入nsp13解旋酶虽能将激活时间缩短至360秒（补充图S10C-E），但仍远慢于延伸过程，说明该构象变化在完整复制机器中仍是限速步骤。

这项研究通过创新的单分子技术，首次描绘出SARS-CoV-2核心RTC激活的三阶段模型（图5）：1）nsp12优先结合RNA；2）招募nsp7/nsp8形成复合体；3）经历缓慢的构象变化（k_conf
≈1/800 s）获得延伸能力。该发现颠覆了传统认知，揭示病毒复制早期存在一个可靶向的"构象检查点"。

其重要意义在于：1）为解释临床突变（如P323L）如何通过稳定nsp12-nsp8界面影响病毒适应性提供机制基础；2）指出靶向nsp7/nsp8介导的构象转变可能阻断病毒复制；3）建立的单分子分析平台为研究其他病毒聚合酶激活机制树立新范式。正如研究者强调，这个强制性的激活步骤可能成为对抗冠状病毒进化的"阿喀琉斯之踵"，为下一代广谱抗病毒药物开发开辟全新方向。