海洋产油微藻Marinichlorella sp. NKG400014的遗传转化技术突破及其在生物燃料开发中的应用

本研究首次成功建立海洋产油微藻Marinichlorella sp. NKG400014的电穿孔（electroporation）遗传转化体系，优化了脉冲宽度（1.5 ms）和启动子选择（内源性GAPDH_1启动子效率最高），其油脂生产率达132.7 mg/L/day。该突破为海水微藻代谢工程（metabolic engineering）和生物燃料经济化生产提供了关键技术支撑。

　　

海洋产油微藻的遗传转化突破

Abstract
微藻作为可持续生物燃料来源备受关注，但遗传转化体系缺失制约其应用。研究团队通过尼罗红筛选从海洋微藻库中鉴定出高产油菌株NKG400014，系统发育分析将其归类为新属Marinichlorella。本研究首次实现该属物种的遗传转化，通过电穿孔技术优化关键参数（3.3 kV/cm场强，1.5 ms脉冲），并证实内源启动子（如GAPDH_1）较外源CaMV 35S启动子效率提升显著。

Introduction
全球淡水危机推动海水微藻研究，Marinichlorella因其耐盐性（7.5% NaCl）和高油脂积累能力成为理想候选。尽管淡水Chlorella转化技术成熟，但海洋株系转化仅见1例报道。启动子选择是转化效率关键——内源启动子在Chlamydomonas reinhardtii和Nannochloropsis中已证实优于外源启动子。

Materials and Methods
菌株培养：NKG400014在BG-11海水培养基（含6% CO₂
）中培养，最佳条件为35°C、1000 μmol photons/m²
/s。
系统发育：通过18S rDNA测序（引物1500F/R）构建邻接树（MEGA 11），显示与Marinichlorella kaistiae KAS005有99.94%相似性。
油脂分析：氯仿/甲醇（2:1）提取总脂，氮限制条件下油脂含量达37%。
质粒构建：比较RBCS2、psaD、GAPDH内源启动子与CaMV 35S启动子驱动nptII/hpt基因表达。
电穿孔：0.2 M甘露醇/山梨醇溶液预处理细胞，3.3 kV/cm场强下获得71.7 transformants/10⁶
cells效率。

Results and Discussion
系统发育：NKG400014与海洋来源菌株形成单系群（bootstrap=100%），支持其归入Marinichlorella新种。
产油特性：1L培养7天生物量达3.89 g/L，油脂含量23.9%（132.7 mg/L/day），与Chlorella vulgaris相当。
转化优化：1.5 ms脉冲宽度转化效率最高，长脉冲（>2.5 ms）导致细胞损伤。
启动子比较：GAPDH_1启动子产生抗生素抗性菌落数达CaMV 35S的2.3倍，印证内源元件优势。

Conclusions
该研究填补了Marinichlorella属遗传操作空白，内源启动子与电穿孔参数的优化为后续代谢工程（如脂质合成途径编辑）奠定基础。海水培养特性使其在可持续生物燃料生产中具显著应用潜力。