基于噬菌体展示纳米抗体的非洲猪瘟病毒K205R蛋白竞争性免疫检测方法的建立与应用

非洲猪瘟（ASF）对全球养猪业构成严重威胁，但缺乏有效疫苗和精准诊断工具。为解决这一问题，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究团队通过噬菌体展示技术筛选出靶向ASFV K205R蛋白的纳米抗体（VHH），并开发了高灵敏度（97.52%）和特异性（97.48%）的竞争性ELISA（Nb-cELISA）。该方法与单抗ELISA一致性达98.98%，为ASF血清学监测提供了新工具，相关纳米抗体还可拓展至其他生物医学应用。

　　

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高度传染性疾病，自1921年首次发现以来已蔓延至全球80多个国家，对养猪业造成毁灭性打击。ASFV基因组复杂，包含150-200种蛋白，且缺乏有效疫苗，使得早期诊断成为防控关键。然而，现有抗体检测方法依赖传统单克隆抗体，存在成本高、稳定性不足等问题。纳米抗体（VHH）因其体积小、稳定性强和易于生产的特点，为诊断技术革新提供了新思路。

中国农业科学院兰州兽医研究所的研究团队聚焦ASFV非结构蛋白K205R——该蛋白在感染早期表达且能激发强免疫应答，是理想的诊断靶点。研究人员通过噬菌体展示技术从免疫骆驼的纳米抗体库中筛选出10种特异性VHH，其中VHH1对天然K205R蛋白结合力最强。基于此开发的竞争性ELISA（Nb-cELISA）仅需30分钟孵育时间，检测限达1:128血清稀释度，且与PCV-2、PRRSV等常见猪病无交叉反应。临床样本验证显示，其与商业单抗ELISA（Mab-cELISA）的符合率达98.98%，证实了技术的可靠性。

关键技术方法
研究采用噬菌体展示技术从免疫库中筛选K205R特异性纳米抗体，通过大肠杆菌表达系统生产并纯化VHH。以HRP标记的VHH1为核心，优化包被抗原浓度（0.5 μg/well）、封闭剂（2% BSA）等参数建立Nb-cELISA。使用ROC曲线确定26.85%抑制率（PI）为临界值，并通过243份已知背景血清评估性能。

研究结果

1. 纳米抗体筛选与鉴定：三轮生物淘洗后获得10种VHH，其中VHH1、VHH2、VHH6和VHH26可结合天然K205R蛋白，Western blot验证其特异性。
2. 检测体系优化：Nb-cELISA在37°C下30分钟即可完成血清竞争反应，灵敏度显著高于传统方法。
3. 临床验证：197份田间样本检测显示，Nb-cELISA与Mab-cELISA的Kappa值为0.961，证实其高一致性。

结论与意义
该研究首次将纳米抗体应用于ASFV抗体检测，解决了传统抗体生产复杂的问题。Nb-cELISA的高性能使其适用于大规模血清监测，尤其在资源有限地区。此外，K205R特异性VHH为ASFV机制研究和治疗开发提供了新工具。论文发表于《Virology Journal》，为ASF防控提供了创新技术支撑。