利用诱变和荧光激活细胞分选技术开发细胞壁通透性增强的普通小球藻突变株及其在生物提取中的应用

本研究针对微藻生物精炼中细胞壁(CW)阻碍胞内物质提取和遗传转化的难题，通过两轮化学诱变结合荧光激活细胞分选(FACS)技术，成功筛选出细胞壁通透性增强的普通小球藻(C. vulgaris)突变株。研究人员首先利用赤藓红B(EB)和荧光素二乙酸酯(FDA)标记筛选出6个细胞壁渗透性突变株(CWP)，随后以钙荧光白(Cf)为标记从CWP1中二次筛选获得2个机械强度降低的CFW突变株。这些突变株在保持正常生长速率的同时，显著提高了蛋白质提取效率，为降低微藻生物质加工成本提供了新策略。该成果发表于《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》。

　　

在追求碳中和的今天，微藻培养因其高效的光合作用效率成为生产生物燃料和高价值化合物的理想选择。然而，以普通小球藻(C. vulgaris)为代表的微藻却面临着一个"铜墙铁壁"的难题——其异常坚固的细胞壁(CW)不仅阻碍了有价值化合物的提取，还使遗传改造变得困难重重。传统采用物理破碎或化学处理的方法不仅成本高昂，还会破坏目标产物的活性。这就像面对一个坚硬的坚果，我们既需要打开它获取果仁，又不能让果仁在打开过程中受损。

来自意大利维罗纳大学的研究团队在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》发表了一项创新研究。他们设计了一个巧妙的"两步走"策略：首先通过化学诱变和荧光标记筛选细胞壁结构改变的突变株，再从中筛选机械强度降低的株系。就像为微藻细胞壁设计了一把"分子钥匙"，既打开了提取通道，又保持了细胞的正常生理功能。

研究人员采用了几个关键技术：1)利用乙基甲烷磺酸盐(EMS)进行化学诱变建立突变库；2)建立基于赤藓红B(EB)和钙荧光白(Cf)的双重荧光标记筛选体系；3)通过流式细胞分选(FACS)高通量筛选目标突变体；4)结合透射电镜(TEM)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析细胞壁结构变化；5)采用湿法研磨和超声波处理评估蛋白质提取效率。

【Isolation of CWP lines, mutants of Chlorella vulgaris with altered cell wall permeability】
研究团队首先建立了基于EB和FDA荧光的筛选体系。EB作为极性染料只能进入死细胞，而FDA能被活细胞代谢滞留。通过模拟细胞壁受损的酶处理组，确定了筛选阈值。经过两轮FACS分选，从861个克隆中筛选出6个EB渗透性显著提高的CWP突变株。有趣的是，这些突变株在光生物反应器(PBR)中的生长速率与野生型相当，打破了"细胞壁改变必然影响生长"的固有认知。

【Structural and spectroscopic characterization of CW in WT and mutant strains】
透射电镜揭示了CWP突变株的精细结构变化。虽然保留了野生型四层结构(外层低密度层LDOL、电子致密内层EDIL等)，但CWP1和CWP5的细胞壁明显增厚，EDIL层电子密度降低。FTIR光谱分析显示β-1,6葡聚糖含量变化可能导致了结构松散。单糖组成分析发现突变株中鼠李糖和葡糖胺减少，半乳糖醛酸增加，这些变化共同构成了"疏松但坚韧"的新型细胞壁结构。

【Characterization of CW composition resistance in WT and mutant strains】
令人意外的是，虽然CWP突变株的细胞壁组成发生变化，但机械破碎后的蛋白质释放量并未显著提高。这就像海绵虽然吸水性强，但挤压时仍不易出水。研究人员意识到，仅靠单轮诱变难以同时实现高渗透性和低机械强度，于是启动了第二轮筛选。

【Isolation of CFW,CW-weakened strains】
以CWP1为亲本，通过Cf染色筛选结合力降低的突变株。从75个克隆中获得的CFW1和CFW2在300 mM NaCl胁迫下表现出更强的敏感性，证实其细胞壁完整性受损。关键的是，经2分钟玻璃珠破碎或30分钟超声处理后，CFW突变株的蛋白质释放量比亲本提高2倍，且细胞大小和生长速率不受影响。

这项研究通过创新的两步筛选策略，首次在C. vulgaris中获得兼具高渗透性和低机械强度的细胞壁突变株。这些发现具有多重意义：首先，CFW突变株将显著降低生物质破碎的能耗成本；其次，增强的细胞壁渗透性为遗传转化提供了便利；更重要的是，研究建立的高通量筛选方法可推广至其他微藻物种。就像为微藻生物精炼找到了一把"万能钥匙"，这项成果将加速微藻从实验室走向工业化生产的进程。未来，结合基因组学手段解析突变位点，有望实现细胞壁特性的精准调控，为可持续生物经济开辟新途径。