分子动力学引导设计高亮度抗光漂白超级折叠绿色荧光蛋白变体YuzuFP

荧光蛋白（FPs）是细胞成像的关键工具，但现有荧光蛋白在亮度与光稳定性方面仍存在局限。英国卡迪夫大学团队通过分子动力学模拟预测色团相互作用网络变化，将sfGFP的H148突变为丝氨酸，开发出新型变体YuzuFP。该变体亮度提升1.5倍，抗光漂白能力增强近3倍，其机制在于S148与色团酚氧基团形成更持久氢键并稳定关键水分子W1。研究成果为长时程活细胞成像提供了更优工具，发表于《Communications Chemistry》。

　　

在生命科学研究中，荧光蛋白（FPs）犹如照亮微观世界的"分子手电筒"，其中源自水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（avGFP）更是构建现代荧光标记体系的基石。尽管已有EGFP（增强型GFP）和sfGFP（超级折叠GFP）等改良版本，但随着显微技术的发展，研究者们始终面临两大挑战：如何让这些"分子灯塔"更亮（提高亮度），以及如何延长它们的"照明时间"（增强光稳定性）。特别是对于需要长时间观察活细胞动态过程的研究，现有荧光蛋白在持续高强度光照下容易发生光漂白（photobleaching），就像电池耗尽的灯泡般逐渐熄灭。

卡迪夫大学D.Dafydd Jones团队在《Communications Chemistry》发表的研究，通过创新性地将分子动力学模拟与蛋白质工程相结合，成功开发出性能显著提升的荧光蛋白变体YuzuFP。这项研究的关键在于聚焦第148位组氨酸（H148）——这个在avGFP家族中高度保守却可能并非最优选的氨基酸残基。研究人员发现，虽然H148能与色团（chromophore）的酚氧基团（CroO）相互作用，但其动态波动导致氢键不稳定，且相邻的结构性水分子W1驻留时间短。通过系统模拟所有20种天然氨基酸在148位的替代效果，团队预测将H148突变为丝氨酸（S148）可形成更稳定的氢键网络。

研究采用分子动力学模拟（10 ns短时程和3×500 ns长时程）、蛋白质定点突变、光谱分析（包括量子产率QY测定和荧光寿命测量）以及单分子TIRF（全内反射荧光）显微技术等方法。HeLa细胞表达LifeAct融合蛋白用于活体验证。

研究结果显示，H148S突变体YuzuFP展现出显著优化的性能：其摩尔消光系数（ε）达61.4 mM^-1
cm^-1
，量子产率（QY）0.92，亮度较sfGFP提高1.5倍。更引人注目的是其实验室条件下的光稳定性——单分子分析显示YuzuFP的半衰期达15.0±0.1秒，是sfGFP（8.3±0.1秒）的近两倍；在活细胞中表现更为突出，LifeAct-YuzuFP融合蛋白的光漂白半衰期达206±3.7秒，较sfGFP融合蛋白（74±0.5秒）提高近3倍。

分子机制研究表明，S148的羟基与色团酚氧基团形成更持久的氢键（占模拟时间的60%），且原子间距更短（0.27 nm）。同时，关键水分子W1的驻留时间从1.5 ns延长至8.5 ns。长时程模拟还发现，S148的主链酰胺基也能参与氢键形成，这种"双保险"机制在天然H148中从未观察到。此外，邻近的F145芳香环与色团距离缩短（从0.90 nm降至0.57 nm），可能通过增强空间屏蔽效应进一步提升稳定性。

这项研究不仅提供了性能优异的荧光蛋白工具YuzuFP，更建立了分子动力学引导的理性设计范式。研究者特别指出，虽然AlphaFold等静态结构预测工具难以处理色团和溶剂化效应，但分子动力学模拟能有效捕捉蛋白质动态行为，为荧光蛋白工程提供了新思路。YuzuFP的成功开发证明，通过精细调控色团微环境——特别是氢键网络和局部水合作用——可协同提升亮度与光稳定性，打破了传统认知中这两个参数此消彼长的限制。

该成果对超分辨显微技术（如STED和TIRF）应用具有重要意义，其长"开启"时间（on-time）特性尤其适合需要长时间追踪分子动态的研究。研究团队已将YuzuFP质粒提交Addgene（ID 240149），方便全球科学家使用。未来，这种基于动态行为分析的蛋白质设计策略有望应用于更多荧光蛋白体系，甚至拓展至其他需要精细调控分子相互作用的蛋白质工程领域。