靶向NRAS mRNA的反义寡核苷酸治疗抑制NRAS突变型黑色素瘤生长并揭示激酶共依赖性

本研究针对NRAS突变型黑色素瘤缺乏直接抑制剂的治疗困境，开发了靶向NRAS mRNA的GapmeR反义寡核苷酸（ASO）。研究发现非突变区靶向的ASO能选择性杀伤NRAS依赖性肿瘤细胞，通过抑制MAPK信号通路诱导凋亡，并在体内外显著抑制肿瘤生长。通过高通量激酶活性图谱（HT-KAM）发现MEK1、FGFR2和CDK4激酶的共依赖性，联合靶向这些激酶可产生协同抗增殖效应。该研究为NRAS突变型黑色素瘤提供了新的治疗策略，克服了直接小分子抑制剂缺失的挑战。

　　

黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌类型，其中约25%的病例存在NRAS基因突变。与BRAF突变型黑色素瘤不同，NRAS突变型患者面临治疗选择有限的困境，这主要归因于两个关键问题：一是NRAS蛋白因其与GTP的高亲和力及缺乏可及的结合位点，难以被小分子直接靶向；二是现有MAPK通路抑制剂易产生耐药性。更严峻的是，NRAS突变型黑色素瘤具有肿瘤厚度大、治疗抵抗快速出现等不良临床特征，导致患者预后较差。这些未满足的临床需求促使研究人员探索新的治疗策略。

美国加州大学旧金山分校的研究团队创新性地采用反义寡核苷酸（ASO）技术直接靶向NRAS mRNA，成功克服了NRAS蛋白"不可成药"的难题。研究发现设计的GapmeR ASO不需要靶向突变位点即可有效抑制肿瘤，通过RNase H1介导的mRNA降解机制，在细胞核和细胞质中均能发挥作用。这项突破性研究发表在《Communications Medicine》上，为NRAS突变型癌症治疗开辟了新途径。

研究采用了多项关键技术：通过DepMap数据库分析NRAS mRNA表达的细胞依赖性；设计靶向NRAS外显子4和7的GapmeR ASO并进行二级结构预测；使用qRT-PCR和免疫印迹验证mRNA和蛋白水平变化；建立裸鼠异种移植模型评估体内疗效；应用高通量激酶活性图谱（HT-KAM）平台鉴定治疗相关激酶共依赖性；采用最高单药（HSA）模型评估联合治疗协同效应。所有细胞系均经过认证和支原体检测，动物实验遵循UCSF动物护理和使用委员会批准的程序。

NRAS-mRNA是NRAS突变型黑色素瘤的可靶向选择性弱点
通过DepMap数据库分析1150个细胞系的CRISPR敲除数据和710个细胞系的RNAi数据，发现NRAS突变型黑色素瘤细胞对NRAS mRNA表达具有特异性依赖（81.8% CRISPR组和66.7% RNAi组），而NRAS野生型细胞无此依赖。亚细胞定位显示NRAS mRNA在核质中均有分布，且核富集程度高于GAPDH和B-ACTIN参照基因。设计的NRAS ASO-1（靶向外显子7）和ASO-2（靶向外显子4）均能特异性结合NRAS mRNA，最小自由能模型预测其靶向区域结构稳定可及。

NRAS ASO处理降低NRAS-mRNA、蛋白水平和MAPK通路信号
两种ASO在NRAS突变型黑色素瘤细胞系（D04和MM415）中可降低NRAS mRNA水平达95%，其中ASO-1效果更显著。免疫荧光和免疫印迹证实ASO处理显著减少NRAS蛋白表达（D04降低66%，MM415降低87%），并选择性抑制MAPK通路信号分子p-ERK1/2（降低50%）和p-S6（降低70-71%），而不显著影响p-AKT水平。这种抑制作用具有特异性，对HRAS和KRAS mRNA表达影响微小。

NRAS ASO处理显著诱导凋亡并特异性抑制NRAS突变型黑色素瘤生长
ASO-1在9个NRAS突变型黑色素瘤细胞系中均显著抑制增殖（如D04抑制78%，MM415抑制82%），而对正常黑色素细胞、肝细胞、结肠细胞和BRAF突变型黑色素瘤细胞无显著毒性。克隆形成实验显示ASO完全抑制MM415细胞集落形成。机制上，ASO处理24小时即可使D04细胞早期凋亡率从11%升至45%，caspase-3/7活性增加3-6倍。在异种移植模型中，每周3次皮下注射ASO（200μg/次）使肿瘤体积缩小48%，且无显著肝毒性。

NRAS在激酶活性特征中的调控作用揭示联合治疗潜力
HT-KAM分析发现NRAS ASO处理后MEK1、FGFR2和CDK4激酶活性显著上调。MEK抑制剂Trametinib处理引起NRAS mRNA表达上调2-10倍，但获得性耐药细胞仍保持对ASO的敏感性。联合用药显示：ASO与Trametinib在D04和MM415细胞中均产生协同效应；与FGFR2抑制剂pemigatinib联用也显示协同作用；与CDK4抑制剂palbociclib联用在D04产生协同效应，在MM415则抵消了单药促增殖作用。而RET激酶抑制剂selpercatinib与ASO联用产生拮抗效应。

这项研究具有多重重要意义：首先，证实靶向非突变区的NRAS ASO可克服突变异质性挑战，为"不可成药"靶点提供了新思路；其次，体内外实验证明ASO治疗具有良好特异性和安全性；第三，通过激酶活性图谱发现的治疗性共依赖性，为设计联合策略提供了科学依据。尤其值得注意的是，这种ASO策略对MEK抑制剂耐药细胞仍然有效，解决了临床耐药难题。该研究不仅为NRAS突变型黑色素瘤患者带来新希望，其技术路线也可拓展至其他RAS家族突变癌症的治疗。未来研究可进一步优化ASO递送系统，并探索更多联合治疗方案。