酿酒酵母内含子RNA体内结构的全转录组解析及其在基因表达调控中的功能机制

为解决真核生物pre-mRNA二级结构调控RNA加工途径的机制难题，斯坦福大学Rhiju Das团队通过剪接抑制富集低丰度pre-mRNA，结合DMS-MaPseq技术首次在体内系统描绘了酿酒酵母（S. cerevisiae）内含子的结构图谱。研究发现79/88个内含子形成"拉链茎（zipper stems）"和新型长茎结构，并通过VARS-seq高通量功能筛选证实这些结构能远程调控内含子保留水平。该研究为理解pre-mRNA折叠如何影响基因表达提供了新范式，成果发表于《Nature Structural & Molecular Biology》。

　　

在真核生物基因表达调控的复杂网络中，内含子作为非编码RNA序列占据基因组大量篇幅，但其三维结构如何参与RNA剪接等核内过程仍是未解之谜。传统研究受限于低丰度pre-mRNA的检测难题，且缺乏系统性功能验证手段。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为经典模式生物，其内含子结构研究对理解从酵母到人类的剪接机制保守性具有重要意义。

斯坦福大学Rhiju Das团队联合曼努埃尔·阿雷斯（Manuel Ares Jr.）等学者在《Nature Structural & Molecular Biology》发表突破性研究。通过创新性地结合剪接抑制剂pladienolide B（pladB）处理与全转录组二甲基硫酸盐（DMS）探测技术，首次实现了酵母内含子结构的体内全景解析。研究揭示79%被测内含子存在稳定二级结构，包括连接5'剪接位点与分支点的"拉链茎"、分支点与3'剪接位点间的"下游茎"，以及能区分pre-mRNA与成熟mRNA的长茎结构。

关键技术包括：1）利用pladB敏感型酵母株（HSH155突变体）抑制剪接以富集pre-mRNA；2）DMS-MaPseq全转录组化学探测获取体内结构数据；3）M2-seq多维化学映射验证体外自主折叠；4）开发VARS-seq（Variants of RNA Structure sequencing）高通量功能平台，对7个内含子的135组茎环结构进行深度突变扫描；5）基于Rosetta的A复合体剪接体建模分析结构约束。

转录组宽结构探测揭示内含子结构特征
通过pladB处理使内含子保留分数（RI fraction）中位数提升10.5倍，DMS反应性分析显示内含子Gini系数显著高于编码区，表明其结构复杂性。在88个高覆盖率内含子中发现301个高置信度茎（helix confidence estimate>70%），其中32个形成拉链茎，21个形成下游茎。

进化保守的结构模式验证
R-scape协变分析证实RPS9A、RPS9B等内含子中功能性茎结构的存在。tRNA内含子结构验证显示DMS数据与已知结构高度一致。比较基因组学显示拉链茎在酵母属（Saccharomyces genus）中广泛保守，尽管序列相似性仅20-30%。

VARS-seq揭示结构-功能关系
对RPL28等内含子的突变文库分析发现，距经典剪接位点远端的结构元件仍能调控RI分数。例如RPS9A茎191-195的破坏使RI降低2.4倍（p<1×10^-4
），而补偿突变可恢复，证实结构特异性调控。

结构分类与功能启示
通过层次聚类将内含子分为7类：含拉链茎（24个）、含拉链茎与下游茎（9个）、仅含下游茎（12个）、其他结构长内含子（13个）、低结构长内含子（29个）及短内含子（7个）。研究发现隐蔽剪接位点区域显著富集高置信度茎（p<0.001），提示结构在剪接保真性中的作用。

这项研究建立了首个真核生物内含子结构-功能图谱，揭示pre-mRNA折叠通过形成特定结构基序远程调控基因表达的新机制。开发的VARS-seq技术为RNA结构功能研究提供了通用工具，而发现的拉链茎等结构特征为理解剪接体与底物的相互作用提供了结构基础。该成果不仅深化了对基础剪接机制的认识，也为人类疾病相关内含子突变的功能解读提供了新视角。