揭示铜绿假单胞菌Pel外多糖输出复合物PelBC的组装机制与门控结构基础

本研究针对铜绿假单胞菌生物膜形成的关键外多糖Pel分泌机制不明的问题，通过冷冻电镜技术解析了外膜输出复合物PelBC的2.5?高分辨率结构，发现由12个脂蛋白PelC组成的周质环锚定在PelBβ桶上的独特组装模式。研究结合分子动力学模拟和单通道电导实验，首次揭示了Plug-S环的动态门控机制，为理解该病原体毒力相关外多糖分泌提供了结构基础，对开发抗生物膜策略具有重要意义。

　　

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为机会性致病菌，在医院获得性感染中占比近20%，尤其对免疫功能低下和囊性纤维化患者构成严重威胁。其强大的致病性主要源于两个特征：快速发展的抗生素耐药性和顽固生物膜的形成。在生物膜基质中，Pel、Psl和藻酸盐三种外多糖(exopolysaccharides, EPS)起着关键作用，但它们的分泌机制长期未被阐明。其中，由pelABCDEFG操纵子编码的Pel多糖作为生物膜早期形成的关键组分，是由α-1,4连接的N-乙酰-D-半乳糖胺残基组成，在周质中部分去乙酰化后带正电，能与胞外DNA交联增强基质稳定性。然而，Pel如何跨越革兰阴性菌复杂的外膜屏障完成分泌，始终是领域内悬而未决的科学问题。

针对这一关键问题，来自德国慕尼黑大学、杜塞尔多夫大学和荷兰格罗宁根大学的研究团队联合攻关，成功解析了Pel外膜输出复合物PelBC的精细结构，并阐明了其动态门控机制。相关成果以2.5?分辨率发表在《Nature Communications》上，为理解这一重要病原体的致病机制提供了分子层面的新见解。研究团队综合运用冷冻电镜(cryo-EM)、分子动力学(MD)模拟和单通道电导测量等前沿技术，首先通过异源表达和纳米盘重建获得了天然组装的PelBC复合物，随后系统分析了其结构特征与动态行为。

研究首先通过蔗糖密度梯度离心证实PelB与PelC共定位于外膜囊泡中。利用组氨酸标签纯化后，将复合物重构于POPC:POPG(70:30)纳米盘中，冷冻电镜分析显示PelBC呈现1:12的化学计量比，其中PelB形成16股反平行β桶，顶部环绕着12个PelC脂蛋白组成的周质环。这一不对称复合物总分子量达250kDa，中央β桶直径约9nm，与纳米盘尺寸完美匹配。结构解析达到2.5?分辨率，首次清晰展示了三个关键结构特征：1) PelC通过膜锚定的酰基链和保守色氨酸Trp-149稳定在膜界面；2) PelB胞外侧被Plug-I、Plug-S和Plug-O三个环状结构封闭；3) β桶内部带负电，与带正电的Pel多糖形成互补。

分子动力学模拟在多种条件下(包括天然类膜环境、不同离子浓度和pH值)系统评估了PelB的构象变化。特别发现Plug-S环(β链15-16间的甘氨酸富集环)具有显著动态性，在生理条件下可短暂开放形成约1nm的通道，足以让线性多糖通过。这一预测在单通道电导实验中获得验证：野生型PelB显示多状态电导波动(25-100pA)，而删除Plug-S的突变体PelBΔPlug-S则呈现持续开放状态(80%时间处于中电导状态)，证实该环是控制通道开关的关键元件。值得注意的是，保守酪氨酸Tyr-1103位于通道入口处，可能通过CH-π相互作用引导多糖转运。

研究还揭示了维持复合物稳定的多重相互作用网络：1) PelC的Asp-119与PelB表面精氨酸(如Arg-905、Arg-944等)形成盐桥；2) 每个PelC亚基的三条酰基链被相邻亚基的Trp-149夹住，该突变导致复合物解离；3) PelB的TPR(四肽重复)域与多个PelC亚基(B/C/D和I/J/K)相互作用，缺失该区域将破坏复合物组装。特别在天然膜环境中，LPS(脂多糖)通过其磷酸基团与PelB胞外侧的Lys-888、Arg-921等正电残基簇结合，进一步稳定了整体结构。

这些发现共同构建了Pel多糖分泌的完整模型：在周质中，部分去乙酰化的Pel多糖(poly-GalNAc)通过带负电的PelB桶内部被导向外膜；到达胞外侧时，动态的Plug-S环在静电作用下发生位移，开放约1nm的通道供多糖通过，同时保守Tyr-1103可能协助引导糖链。相邻的PelC环不仅稳定了复合物组装，还可能通过其部分带负电的中央孔协助多糖定向转运。

该研究首次在原子水平揭示了铜绿假单胞菌重要毒力因子Pel的分泌机制，解决了领域内长期存在的关键问题。解析的PelBC结构代表了外多糖转运体家族的新范式，其独特的脂蛋白环组装模式和动态门控机制为针对生物膜的新型抗菌策略开发提供了精准靶点。特别值得注意的是，Plug-S环作为可药物化的关键调控元件，其构象变化机制为设计小分子抑制剂阻断Pel分泌开辟了新途径。此外，研究建立的多学科交叉方法(从高分辨结构到动态功能分析)为其他微生物分泌系统的研究提供了范本，对理解细菌适应性进化具有重要意义。