蔗糖驱动的碳氧化还原平衡消除酵母克雷伯效应并提升能量代谢效率

为解决酵母在工业发酵中因克雷伯效应（Crabtree effect）导致的碳损失和能量效率低下问题，研究人员通过引入蔗糖磷酸解途径（sucrose phosphorolysis pathway）和敲除磷酸葡萄糖异构酶基因PGI1，成功将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）改造为克雷伯效应阴性（Crabtree-negative）菌株。结合合成能量系统（synthetic energy system）调控NADH/NAD+ 比例，该菌株显著提升了乳酸（lactic acid）、3-羟基丙酸（3-HP）等非乙醇产物的产量（8-11倍）。这项研究为微生物细胞工厂的碳高效利用提供了新策略，发表于《Nature Communications》。

　　

在追求环境友好和资源可持续利用的背景下，利用微生物合成化学品和食品原料的生物制造技术备受关注。然而，工业规模生产的核心挑战在于如何优化碳利用效率以实现碳中和目标。酿酒酵母作为工业生产的模式生物，因其遗传背景清晰和鲁棒性强被广泛应用，但其在高糖环境下优先通过发酵而非呼吸作用产生能量的“克雷伯效应”，导致大量碳以乙醇形式流失，严重限制了非乙醇类化学品的合成效率。传统策略如敲除丙酮酸脱羧酶基因（PDC1/5/6）虽能减少乙醇积累，但会引发乙酰辅酶A（acetyl-CoA）供应不足和NAD⁺
再生障碍。因此，如何在不破坏氧化还原平衡的前提下重构酵母中心碳代谢，成为突破克雷伯效应瓶颈的关键。

中国的研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，通过代谢工程和合成生物学手段，成功将酵母转化为克雷伯效应阴性菌株。研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建突变菌株，通过RNA-seq转录组分析验证代谢重编程效果，并利用高效液相色谱（HPLC）测定代谢产物（如乙醇、乳酸、3-HP）浓度。此外，通过ATP含量和NADH/NAD⁺
比率检测评估能量代谢状态，结合5-L生物反应器批量发酵验证菌株性能。

蔗糖磷酸解替代天然水解途径
研究人员首先敲除酵母内源性蔗糖水解酶基因（SUC2、MAL12/32等），引入明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）的蔗糖磷酸化酶基因LmSP，将蔗糖分解为果糖和葡萄糖-1-磷酸（G1P），避免ATP依赖的水解过程。通过优化双转运蛋白（PvSUF_1209F
+MAL11），菌株ZQS15的ATP生成效率提升，最大比生长速率（μ_max
）达0.21 h^-1
（图1d-g）。

向克雷伯效应阴性状态转变
敲除肌醇焦磷酸酶基因OCA5（调控EMP途径与TCA循环平衡）和磷酸葡萄糖异构酶基因PGI1后，菌株ZQS18完全消除了乙醇积累（图2h），NADH/NAD⁺
比率显著降低（图2j）。转录组分析显示，EMP途径通量下降而TCA循环和电子传递链（ETC）相关基因上调（图3a-b），证实代谢流向呼吸作用偏移。

合成能量系统优化ATP供应
过表达线粒体外膜NADH脱氢酶（NDE1/NDE2）和转氢酶（AcTH）的合成能量系统，使菌株ZQS65在TCA循环受阻时仍能维持生长（图5f）。通过引入磷酸酮醇酶（LmPK）和磷酸转乙酰酶（CkPTA）途径，进一步减少乙醇溢出代谢，ATP含量提升1.8倍（图5c）。

非乙醇产物合成效率提升
改造后的菌株在合成乳酸、3-HP、对香豆酸（p-coumaric acid）和法尼烯（farnesene）时均表现优异。例如，表达乳酸脱氢酶（LILDH）的ZQS68乳酸产量达3.29 g/L，较对照提升11倍（图6c）；而表达突变型丙二酰辅酶A还原酶（CaMCR-CN94IVK1107W）的ZQS71的3-HP产量为1.96 g/L，提高8.2倍（图6e）。

这项研究通过蔗糖磷酸解途径和合成能量系统的协同设计，首次实现了酵母克雷伯效应的完全消除，使碳回收率和能量代谢效率达到工业应用水平。其创新性体现在：（1）通过PGI1敲解除EMP与PPP（戊糖磷酸途径）的串扰，减少碳损失；（2）合成能量系统实现NADH/NAD⁺
动态平衡，突破传统策略对TCA循环的依赖；（3）双转运蛋白机制优化蔗糖利用效率。该成果为微生物合成高附加值化合物提供了通用型底盘细胞，对生物制造产业的碳减排具有重要实践意义。