纳米孔测序技术实现8-氧代脱氧鸟苷(8-oxo-dG)的直接检测及其在基因组氧化损伤研究中的应用

本研究通过合成寡核苷酸构建训练数据集，开发了基于纳米孔测序的深度学习模型，首次实现8-oxo-dG的单核苷酸分辨率直接检测。在诱导氧化应激的细胞模型中，发现8-oxo-dG在基因组中分布不均且与5-mC存在互作关系，为理解氧化损伤导致的突变机制和表观遗传调控提供了新见解。

　　

基因组DNA持续遭受氧化损伤，其中8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷(8-oxo-dG)是最常见的损伤形式，与突变发生、表观遗传调控和基因表达密切相关。然而现有检测方法依赖间接手段，且存在分辨率低、假阳性率高、无法覆盖重复区域等技术瓶颈。更关键的是，由于缺乏训练数据，纳米孔测序这一直接检测技术尚未建立8-oxo-dG识别模型。针对这一挑战，荷兰乌得勒支大学医学中心等机构的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果。

研究团队设计合成包含8-oxo-dG的110种寡核苷酸，通过连接构建长片段训练数据集。采用两步深度学习策略：先微调Bonito碱基识别模型将8-oxo-dG准确识别为G；再开发Remora-like修饰检测模型，通过特征工程将特异性提升至Q47（每千万碱基<1个假阳性）。在诱导氧化应激的RPE1-hTERT-DAAOH2B细胞模型中，实现8-oxo-dG与5-mC的单分子同步检测。

主要技术方法包括：1）设计含8-oxo-dG的合成寡核苷酸文库；2）纳米孔测序（MinION R9.4.1平台）；3）Bonito+Remora深度学习框架；4）使用T2T参考基因组数据验证；5）氧化应激细胞模型（RPE1-hTERT-DAAOH2B系）。

研究结果：

1. 8-oxo-dG的纳米孔检测特征
   通过合成寡核苷酸证实8-oxo-dG显著影响原始信号（信号值比预期高12.5%），且对侧胞嘧啶易出现碱基识别错误（12.3% vs 5.0%）。信号差异在110种5-mer背景中呈现多样性，与嘧啶差异最大。

2. Bonito碱基识别模型微调
   微调后模型将8-oxo-dG识别为G的错误率降至3%，同时基因组碱基识别准确率提升（错误率14%→10%）。

1. 高特异性检测模型
   通过类别权重调整和特征工程（加入预期信号等），模型在0.95阈值下实现Q47特异性，58个5-mer实现零假阳性。但灵敏度降至35%，反映稀有修饰检测的权衡。

2. 基因组8-oxo-dG分布特征
   氧化应激使8-oxo-dG增加16%（p=0.016），且在GC>50%区域富集。端粒区含量异常低（仅检测到2个），提示高效修复机制。复杂重复区域变异最大，5'UTR含量最高。

3. 突变特征分析
   8-oxo-dG三核苷酸特征与COSMIC signature 18/36相似度仅0.33，突变率更接近基因组3-mer丰度（相似度0.95），提示突变效率受序列背景调控。

4. 与5-mC的互作关系
   8-oxo-dG周围2kb内5-mC显著降低（近端45% vs 远端54%），且与3-mer富集程度相关。GG背景的5-hmC升高至6%，支持OGG1招募TET酶的主动去甲基化假说。

这项研究建立了纳米孔测序检测稀有DNA修饰的新范式，首次揭示8-oxo-dG在基因组中的非随机分布及其与表观遗传调控的复杂关系。技术层面，合成DNA训练策略可推广至其他修饰研究；生物学层面，发现端粒等特殊区域的氧化损伤修复特征，为理解突变热点形成和衰老机制提供新视角。特别是8-oxo-dG与5-mC的互作证据，为氧化应激影响表观遗传的分子机制开辟了新的研究方向。