人源α3 β甘氨酸受体通过M3/M4环磷酸化与2,6-DTBP相互作用的调控机制及其在疼痛治疗中的意义

本研究揭示了炎症性疼痛中α3 β甘氨酸受体（GlyR）通过M3/M4环磷酸化抑制氯离子传导的分子机制，并发现小分子2,6-DTBP通过同时结合跨膜结构域（TM）和磷酸化M3/M4环特异性增强受体活性。结合冷冻电镜（cryo-EM）和单分子FRET技术，首次阐明磷酸化诱导的M3/M4环构象变化调控离子通道开放的动态过程，为开发非精神类镇痛药物提供新靶点。

　　

慢性疼痛困扰着全球20%以上人群，而脊髓背角中高表达的α₃
β甘氨酸受体（GlyR）是调控炎症性痛觉敏感的关键靶点。当机体处于炎症状态时，前列腺素E₂
（PGE₂
）通路会促使GlyR α₃
亚基的M3/M4细胞内环中S346位点发生磷酸化，导致氯离子传导受阻，痛觉信号增强。尽管临床前研究已发现小分子2,6-二叔丁基苯酚（2,6-DTBP）能特异性增强磷酸化α₃
β GlyR的活性，但其分子机制和结构基础始终成谜。

中国科学技术大学的研究团队通过冷冻电镜解析了人源α₃
β GlyR在天然膜环境（纳米盘）和去垢剂中的高分辨率结构，并结合单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术，首次捕捉到磷酸化诱导的M3/M4环动态构象变化。研究发现，磷酸化模拟突变（S346E）会促使M3/M4环向离子传导孔道压缩，改变孔道局部静电环境并引发跨膜区不对称扩张；而2,6-DTBP通过同时结合跨膜区（TM）的A288/F388位点和磷酸化M3/M4环，进一步稳定该构象从而增强氯离子传导。该研究发表于《Nature Communications》，为理解Cys-loop受体家族中无序环区的调控机制提供了范式。

关键技术包括：1）构建工程化α₃
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GlyR以提高蛋白稳定性；2）3.6-3.8 ?分辨率冷冻电镜结构解析；3）单分子FRET实时监测M3/M4环空间构象；4）电生理验证磷酸化及2,6-DTBP对通道功能的调控。

研究结果
工程化GlyR重现野生型调控特性
通过删除α₃
亚基M3/M4环部分片段（ΔA329-S337）构建的α₃
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GlyR保留了野生型的甘氨酸激活曲线（EC₅₀
≈160 μM）和PGE₂
通路抑制效应。S346E突变使电导降低50%，而2,6-DTBP仅对磷酸化模拟体产生3.7倍增强效应，证实工程化受体是理想研究模型。

磷酸化与2,6-DTBP改变孔道构象
冷冻电镜结构显示，磷酸化模拟体（α₃
S346Eβ-gly）的跨膜区出现不对称收缩，而2,6-DTBP结合后孔道扩张至3.9 ?半径，形成"超开放"状态。关键发现是相邻α₃
亚基间界面增宽，并在间隙出现未建模密度，提示存在稳定构象的未知分子。

M3/M4环向孔道动态压缩
smFRET实验首次捕捉到磷酸化诱导的构象变化：S346E突变使M3/M4环与孔道距离缩短（FRET值从0.2升至0.5），2,6-DTBP进一步将其稳定在0.75高FRET状态。而野生型受体中该环高度柔性，不受2,6-DTBP影响。

双位点结合决定药物特异性
突变研究揭示2,6-DTBP需同时作用于TM区（A288/F388）和磷酸化M3/M4环才能增强异源α₃
β GlyR；而同源α₃
GlyR仅需TM结合即可激活，解释了药物对磷酸化受体的选择性。

讨论与意义
该研究阐明了炎症疼痛中GlyR功能抑制的结构基础：磷酸化M3/M4环通过构象压缩和负电荷聚集双重机制阻碍氯离子传导。2,6-DTBP的创新作用模式——"双锚定"于TM区和磷酸化环——为设计非成瘾性镇痛药提供了新思路。更深远的是，该工作建立了研究Cys-loop受体家族中无序环区调控的通用方法，对阿尔茨海默症（GlyR trafficking异常）和精神分裂症（GlyT1抑制剂靶点）等疾病研究具有启示意义。未来可针对TM-M3/M4界面开发变构调节剂，实现精准镇痛。