CBASS Cap5内切酶效应蛋白降解DNA的分子机制解析：细菌免疫防御的新视角

为解决细菌抗病毒免疫中DNA降解机制不明的问题，研究团队通过高分辨率结构解析，首次揭示了CBASS系统效应蛋白Cap5在3'2'-cGAMP激活下通过四聚体HNH内切酶域切割DNA的分子机制。该研究阐明了Cap5作为非特异性核酸酶的独特作用模式，并证实染色体编码的Cap5可被外源环核苷酸激活抑制细菌生长，为开发新型抗生素提供了理论依据。

　　

在细菌与病毒（噬菌体）持续演化的军备竞赛中，CBASS（cyclic oligonucleotide-based antiphage signaling system）作为原核生物的重要免疫防御系统，通过产生环核苷酸第二信使激活效应蛋白，诱导感染细胞自杀以阻断病毒传播。然而，效应蛋白如何精确执行DNA降解这一终极防御指令，始终是未解之谜。来自美国西奈山伊坎医学院等机构的研究团队在《Nature Communications》发表研究，首次捕获了Pseudomonas syringae（Ps）Cap5效应蛋白在激活状态下切割DNA的原子级“犯罪现场”，揭示了其独特的四重奏式切割机制。

研究团队主要运用了以下关键技术：1）X射线晶体学（分辨率达1.67 ?）解析DNA-Cap5复合物结构；2）位点特异性突变验证关键催化残基；3）体外质粒切割实验评估酶活性；4）全基因组纳米孔测序分析细菌逃逸突变体；5）细菌生长抑制实验验证染色体编码Cap5的外源激活可行性。

DNA-Cap5复合物的四重奏架构
通过19-mer自互补DNA与3'2'-cGAMP激活的Cap5共结晶，研究发现DNA结合状态下的PsCap5保持二聚体-二聚体组成的四聚体架构。晶体不对称单元包含一个Crisscross二聚体（原体A/B）和单链DNA，通过空间群对称性形成完整的DNA双链结合四聚体。值得注意的是，电子密度图显示DNA存在两种构象异构体（A/B），导致两条Watson-Crick配对双链在四聚体结合位点产生1 bp偏移。

HNH域的辩证统一
四聚体中的四个HNH内切酶域呈现“两活两静”的辩证状态：

• 活性状态的HNH_A
  和HNH_C
  ：具有经典ββα拓扑结构（β3-β4-α4），催化残基His56（实验中突变为Ala）位于β3末端，可协同切割DNA双链（T10-A11和A11-A12位点）。
• 失活状态的HNH_B
  和HNH_D
  ：形成替代性β^I
  1折叠（残基56-59），使Ala56偏离活性位点7.5 ?，仅保留DNA结合功能。

非特异性切割的分子基础
所有HNH域仅与DNA磷酸骨架相互作用（不接触碱基），解释了Cap5的非特异性：

• 活性域通过Lys21、Thr25等残基结合4个连续磷酸基团
• 失活域通过Asn15、Thr16等残基辅助稳定复合物
• Asn15Glu-Lys21Glu双突变体完全丧失切割能力

催化中心的电荷悖论
尽管活性中心表面带负电（Glu53/Asp92），DNA仍能有效结合。研究发现：
1）催化Mg²⁺
通过His91/Asp95协调剪刀磷酸和水分子的六配位结构
2）结构Mg²⁺
桥连HNH_A
/HNH_C
域中和负电荷
3）DNA小沟宽度扩展至17.6 ?（标准B-DNA为11.7 ?）

染色体编码Cap5的外源激活
在Pseudomonas brenneri中证实：

• 25-100 μM 3'2'-cGAMP可剂量依赖性抑制细菌生长（10^-5
  稀释度无克隆）
• 20小时培养后出现逃逸突变体，基因组测序发现：
  → SAVED结构域被IS3转座酶插入破坏
  → 类似CRISPR-Cas系统失效的逃逸机制

该研究不仅首次揭示了HNH结构域作为独立非特异性核酸酶的工作模式，更开辟了通过外源环核苷酸激活细菌自杀程序的新型抗菌策略。特别值得注意的是，Cap5四聚体中活性/失活HNH域的拓扑转换，展现了自然界蛋白质结构的惊人可塑性。这些发现为理解细菌免疫防御的分子基础提供了关键框架，也为开发针对CBASS系统的新型抗菌药物奠定了理论基础。