通过MicL sRNA诱导下调脂蛋白Lpp促进大肠杆菌胞外肽生产的创新策略

这篇研究通过构建可诱导的MicL sRNA表达系统，实现了大肠杆菌生产过程中脂蛋白Lpp（Lpp）的动态下调，显著提高了重组融合肽CASPON? -SST的胞外分泌率（80-100%）。该系统采用不同启动子协调肽与MicL的时序表达，首次在碳限制补料培养中验证了Lpp可调控下调对膜通透性的优化作用，为生物制药工艺开发提供了新型膜透性调控工具。

　　

外膜通透性调控的创新突破

材料与方法
研究采用大肠杆菌BL21(DE3)作为底盘菌株，通过"all-in-one"方法将CASPON-SST表达盒整合至attTn7位点。肽段通过OmpA信号序列定位于周质空间，MicL sRNA通过pET30a^cer
衍生质粒（多拷贝）或pROCOLI载体（单拷贝）表达。为解耦表达系统，构建了ΔaraABCD突变株BΔara，并采用阿拉伯糖（LAra）和IPTG分别诱导MicL与肽的表达。

培养系统涵盖48孔微孔板（BioLector?）和1.5L搅拌罐反应器（DASGIP?）两个规模。通过SYTOX?绿色荧光染料摄取实验监测外膜通透性变化，结合流式细胞术定量分析。采用改良的Lpp分级分离方法（1% SDS煮沸结合溶菌酶处理）制备Western blot样品，使用Princeton大学提供的兔源抗Lpp抗体进行检测。

关键发现
诱导型Lpp下调系统的构建
初始实验发现lpp基因敲除株在碳限制补料培养中表现不佳。通过构建pMicL^MC
(lac)质粒（T7启动子控制），在2 μmol IPTG/g DCM诱导下，Lpp mRNA水平降低30倍，但肽产量下降30%。提高诱导剂浓度至20 μmol/g DCM后，不仅恢复了肽产量（最高45 mg/g DCM），还实现了80-100%的胞外分泌率。

时序调控的优化策略
解耦表达系统（pMicL^MC
(ara)）在微孔板培养中展现出显著优势：提前6.3代诱导MicL表达使Lpp蛋白几乎完全缺失，单细胞荧光信号增强100倍，胞外肽比例提升至81%。值得注意的是，多拷贝质粒系统使总肽产量增加48%，提示Lpp合成减少可能释放了占细胞5%的核糖体资源。

生产规模的验证
在搅拌罐反应器中，LAra诱导的MicL表达使Lpp mRNA水平骤降2000倍（20小时培养）。尽管生物量降低，但特异性肽产量提高1.9倍，70%的CASPON-SST进入培养基。透射电镜显示下调Lpp的细胞呈现波浪状外膜，外膜囊泡（OMVs）主要在细胞极区形成。

机制解析与意外发现
研究发现培养基成分显著影响系统性能：低渗透压的微孔板培养基中，Lpp下调对生长影响较小；而高Mg²⁺
/Ca²⁺
的STR培养基则增强OMVs稳定性，导致HPLC检测困难。Western blot鉴定出胞外存在LamB、OmpF等外膜蛋白，证实OMVs的形成。有趣的是，Lpp下调显著减少了CASPON-SST的降解片段，提示周质蛋白酶接触减少。

应用前景与局限性
该研究首次在工业相关条件下实现MicL介导的Lpp动态调控，为重组肽生产提供了膜透性精细调控工具。但需注意"通透性"与"泄漏性"的差异：SYTOX摄取增加（通透性）不一定对应肽分泌增强（泄漏性）。未来研究应关注培养基成分、生长速率与诱导时序的协同优化，特别是在OMVs规模化生产方面的应用潜力。