VE-钙黏蛋白丝氨酸665位点磷酸化在炎症诱导血管通透性中的关键作用及其独立调控机制

这篇研究通过构建VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）Y658F和S665V点突变基因敲入小鼠模型，揭示了S665磷酸化在组胺和血管内皮生长因子（VEGF）诱导的血管通透性中的核心作用，而Y658磷酸化在此过程中无关紧要。研究发现S665和Y685磷酸化具有独立但协同的调控机制，为靶向内皮屏障功能障碍提供了新靶点。

　　

引言：内皮屏障调控的分子枢纽
VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）作为内皮细胞粘附连接的核心组分，其磷酸化修饰是调控血管屏障功能的关键开关。既往研究已明确酪氨酸685（Y685）和731（Y731）位点的功能，但丝氨酸665（S665）和酪氨酸658（Y658）的体内作用仍存争议。本研究通过创新性构建S665V（丝氨酸→缬氨酸）和Y658F（酪氨酸→苯丙氨酸）点突变小鼠模型，系统解析了这两个位点在炎症介导的血管通透性调控中的贡献。

材料与方法：精准遗传修饰与多维验证
采用重组酶介导的盒式交换（RMCE）技术，将突变型VE-cadherin cDNA定点整合至内源基因座。通过免疫印迹验证突变蛋白表达水平与野生型无差异，免疫共沉淀证实α/β/γ-连环蛋白（catenin）结合能力保留。创新性开发了针对pY658的单克隆抗体L36.1和pS665的多克隆抗体VD53，经突变体转染实验验证特异性。皮肤Miles实验定量血管渗漏，共聚焦显微镜分析VE-cadherin内吞动力学。

结果1：S665而非Y658是通透性调控的关键位点
在人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，组胺和VEGF强烈诱导S665磷酸化（5分钟达峰，15分钟衰减），而Y658仅微弱激活。体内实验显示，S665V小鼠对组胺/VEGF诱导的皮肤渗漏减少70%，但Y658F小鼠反应与野生型无异。内吞实验进一步揭示，S665V突变完全阻断组胺诱导的VE-cadherin内化，Y658F则无影响。

结果2：磷酸化级联的时空特异性
动态监测显示S665磷酸化早于Y685（峰值分别为5分钟和15分钟），但两者互不依赖：在S665V突变体中Y685仍可被凝血酶激活，Y685F突变也不影响S665磷酸化。三种炎症介质（VEGF/组胺/凝血酶）均能激活这两个位点，提示其作为共同下游节点的普适性。

讨论：多层级屏障调控网络的构建
研究发现S665与Y685通过平行通路协同调控内皮屏障：

1. S665通路：通过PAK1激酶募集β-arrestin2，启动网格蛋白依赖的内化；
2. Y685通路：经Src激酶触发K626/K633泛素化，促进囊泡转运。
   这种"双锁机制"既可放大信号（如炎症时快速打开连接），又防止误激活（如血流剪切力仅通过Y658-LGN轴调控血管重构）。

临床转化价值
该研究为以下领域提供新思路：

1. 脓毒症等炎症性血管渗漏综合征的靶向治疗；
2. 肿瘤转移中VEGF介导的血管"开窗"阻断策略；
3. 设计特异性磷酸化位点抑制剂（如靶向S665的竞争性肽段）。

技术突破与局限
创新点在于：

• 首个体内验证S665功能的研究；
• 揭示磷酸化位点的时空编码特性。
  局限包括未解析S665特异性磷酸酶，以及Y658在动脉粥样硬化等慢性炎症中的作用待探索。

结论
本研究确立了VE-cadherin-S665作为炎症性血管通透性的核心调控点，其与Y685构成的"磷酸化双开关"为理解内皮屏障动态平衡提供了新范式，为相关疾病的精准干预奠定理论基础。