极端嗜热古菌Thermoproteus sp. AZ2来源β-葡萄糖苷酶的结构解析与热稳定性机制研究

本研究针对极端环境下β-葡萄糖苷酶(BGL)热稳定性不足的工业应用瓶颈，解析了Thermoproteus sp. AZ2来源的TsBGL2三维结构及催化机制。通过晶体结构解析和截短突变体构建，首次揭示其C端长链对维持95°C高温活性的关键作用，为设计耐热BGL提供了分子蓝图，对生物质转化领域具有重要应用价值。

　　

在生物能源和绿色化学领域，纤维素的高效降解始终是核心挑战。作为纤维素降解的最后一步关键酶，β-葡萄糖苷酶(BGL)能将纤维二糖转化为葡萄糖，但其工业应用长期受限于常温酶的热稳定性不足。极端环境微生物成为解决这一难题的新突破口——Thermoproteus sp. AZ2这类能在沸腾温度下存活的古菌，其分泌的BGL可能蕴含独特的热适应机制。

上海科技大学的科研团队在《Archives of Biochemistry and Biophysics》发表的研究，首次揭示了Thermoproteus sp. AZ2来源的TsBGL2的分子奥秘。通过X射线晶体学技术解析2.1?分辨率的三维结构，结合定点突变和酶动力学分析，发现该酶在99°C处理10小时后仍能保持95%以上活性，其热稳定秘诀在于特殊的C端结构域。

研究采用三大关键技术：1）基于pET22载体的原核表达系统构建His₆
-SUMO标签融合蛋白；2）利用Superdex 200凝胶色谱和结晶筛选获得三种晶体形态；3）通过圆二色谱和差示扫描量热法分析蛋白质热变性特征。

【结构特征】
2.9?分辨率的晶体结构显示TsBGL2具有典型GH1家族(α/β)₈
-桶状催化核心，但在C端存在独特延伸。与中温BGL相比，其表面电荷分布和疏水核心 packing 更为致密，这解释了其在pH5.0酸性环境下的稳定性。

【热稳定机制】
截短突变体Δ(473-495)TsBGL2的构建证实，缺失C端34个氨基酸导致酶在90°C半衰期从8小时骤降至15分钟。分子动力学模拟显示，野生型的C端通过形成"分子锚"稳定整个(α/β)₈
桶状结构，该发现为理性设计热稳定BGL提供了新策略。

【催化特性】
底物结合实验显示，TsBGL2的活性口袋入口处存在芳香族氨基酸"栅栏"，这种特殊构象使其对pNPG（对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）的催化效率(k_cat
/K_m
)达到4.8×10³
s^-1
·mM^-1
，且葡萄糖产物抑制效应较中温BGL降低60%。

讨论部分指出，该研究首次将古菌BGL的极端稳定性与其C端结构域直接关联。Chaoneng Ji等作者强调，TsBGL2的(α/β)₈
桶状核心与真核BGL高度保守，但其C端延伸可作为蛋白质工程的特异性改造靶点。这种"模块化"设计思路，使得在不影响催化活性的前提下定向增强热稳定性成为可能，为开发适用于高温生物炼制过程的下一代BGL奠定了基础。研究获得的9LHH、9LHI、9LHG三套晶体结构数据，已为全球15个研究组开展后续改造提供了关键模板。