脯氨酸Stickland发酵通路调控艰难梭菌孢子成熟的机制研究及其在肠道病原体传播中的意义

（推荐语）本研究揭示了艰难梭菌（C. difficile）通过脯氨酸Stickland代谢通路（PrdR-PrdA）调控孢子成熟的新机制：脯氨酸作为能量信号通过PrdR抑制孢子形成，而其还原酶PrdA则通过激活早期孢子形成因子（SigE/SigK）促进孢子发育。首次发现代谢终产物5-氨基戊酸（AMV）可被PrdR依赖性通路利用，为靶向干预孢子传播提供了新靶点。

　　

脯氨酸Stickland发酵通路在艰难梭菌孢子成熟中的核心作用

ABSTRACT
艰难梭菌（Clostridioides difficile）作为严格厌氧病原体，其休眠孢子是环境传播的关键载体。研究首次阐明氨基酸发酵（脯氨酸Stickland途径）与孢子发育的关联：脯氨酸通过PrdR-PrdA双通路调控孢子成熟，代谢终产物5-氨基戊酸（AMV）的意外利用机制为理解病原体能量代谢开辟新视角。

INTRODUCTION
艰难梭菌依赖毒素（TcdA/TcdB）和孢子双重毒力因子致病。尽管营养匮乏已知可刺激孢子形成，但具体代谢物调控机制尚不明确。该菌独特的氨基酸发酵能力（如脯氨酸通过六酶复合体PrdA-F还原为AMV）是其肠道定植的能量来源，但该通路与孢子形成的关联仍是空白。

RESULTS

脯氨酸还原酶是高效孢子生产的支持者
基因敲除实验显示，prdA突变体产孢量较野生型（18.4→6.5 CFU）下降65%，而prdR调控因子缺失则使孢子产量增加80%。添加30 mM脯氨酸可抑制野生型孢子形成，但反而促进prdA突变体产孢，表明脯氨酸存在非代谢依赖性调控。AMV补充实验证实其通过独立于PrdA的PrdR通路支持生长，首次揭示AMV可作为替代碳源。

脯氨酸与氨基戊酸的PrdR依赖性双通路代谢
生长曲线分析显示，AMV使prdA突变体OD₆₀₀
提升3.8倍，但对prdR突变体无影响，证实AMV利用依赖PrdR而非经典脯氨酸还原途径。这种代谢分流可能是艰难梭菌应对肠道营养波动的生存策略。

脯氨酸还原酶促进孢子完全成熟
相差显微镜观察发现prdA突变体phase-dark未成熟孢子占比达47%（野生型仅12%），且乙醇抗性孢子减少72%。透射电镜显示其孢子皮层发育缺陷，这与孢子特异性sigma因子（SigE/SigK）表达下调直接相关。

孢子形成期的脯氨酸消耗支持高效萌发
纯化孢子萌发实验显示，prdA突变体在胆汁酸盐刺激下OD₆₀₀
下降延迟15分钟，表明能量代谢缺陷导致孢子发育不全。qPCR证实其晚期孢子基因cotA表达量仅为野生型的7%。

脯氨酸分解代谢广泛影响营养调控网络
转录组分析发现prdA突变体中CcpA调控的寡肽转运体oppB表达降低57%，CodY靶基因ilvC下调63%，揭示脯氨酸代谢与全局营养感应系统的交叉调控。

DISCUSSION
与芽孢杆菌不同，艰难梭菌通过古老氨基酸发酵通路精细调控孢子发育：①脯氨酸作为"营养充足"信号通过PrdR抑制孢子启动；②其分解产生的NAD⁺
通过激活SigE/SigK级联促进孢子成熟；③AMV的PrdR依赖性利用途径可能是肠道微环境适应的进化创新。该研究为开发靶向氨基酸代谢的抗孢子传播策略奠定理论基础。

MATERIALS AND METHODS
采用等位基因交换构建prdA/R突变体（630Δerm背景），通过70:10产孢培养基（70% SMC+10% BHIS）评估孢子产量。孢子纯度经蔗糖梯度离心确认（>95% phase-bright），qPCR使用rpoC内参基因，数据经ΔΔC_t
法分析。全基因组测序由SeqCenter完成（Illumina NextSeq2000平台）。