熔解阵列技术实现结核分枝杆菌gyrA突变体快速鉴定与定量：助力氟喹诺酮耐药性精准监测

（编辑推荐）本研究开发了MeltArray MTB/FQs检测技术，通过多重PCR与熔解曲线分析，可在3小时内一次性检测结核分枝杆菌（MTB）gyrA基因QRDR区的11种关键突变，并实现低至5%的异质性耐药（heteroresistance）检测。相比传统方法（如Sanger测序和表型药敏试验pAST），其灵敏度达95.23%，特异性达99.32%，为临床快速诊断氟喹诺酮（FQs）耐药性及预判广泛耐药结核（pre-XDR-TB）提供高效工具。

　　

引言

氟喹诺酮类（FQs）药物是治疗耐多药结核病（MDR-TB）的核心药物，但其耐药性加剧了预判广泛耐药结核（pre-XDR-TB）的流行。结核分枝杆菌（MTB）对FQs的耐药性主要源于gyrA基因喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变，尤其是第90、91和94位密码子。这些突变不仅导致不同水平的耐药性，还可能通过共突变或低丰度异质性耐药（heteroresistance）影响治疗效果。现有分子检测技术（如GenoType MTBDRsl和Xpert MTB/XDR）在突变分型和异质性耐药检测方面存在局限性，亟需更高效的解决方案。

材料与方法

MeltArray MTB/FQs检测设计
该技术通过双重PCR实现：一组引物和TaqMan探针定量gyrB基因（HEX通道），另一组引物与11个突变特异性介导探针（覆盖G88A/D89N等11个QRDR突变）通过熔解曲线分析（FAM/HEX/ROX/Cy5通道）生成“荧光-熔解温度（T_m
）”编码，3小时内完成检测。

性能验证

• 灵敏度：质粒DNA检测限（LOD）为50拷贝/反应，临床样本中MTB检测限为200菌体/mL。
• 异质性耐药检测：在50,000拷贝/反应下可识别5%突变比例，低浓度（500拷贝/反应）下仍可检测部分5%突变。
• 特异性：对24种非结核分枝杆菌（NTM）和18种呼吸道病原体无交叉反应。

临床评估

样本分组

• Group 1（442份培养样本）：MeltArray检出31种突变组合，包括8种单突变和23种多突变。与pAST相比，灵敏度达95.23%，特异性99.32%。Sanger测序漏检的5例耐药样本均被MeltArray检出，且ddPCR证实其可检测低至0.92%的突变比例。
• Group 2（121份痰液-培养配对样本）：痰液直接检测灵敏度90.32%，培养样本灵敏度95.24%，特异性均为100%。
• Group 3（285份MTB阳性痰液）：与MeltPro MTB/FQs试剂盒相比，阳性符合率（PPA）93.75%，阴性符合率（NPA）98.10%。

突变定量算法
基于多项式回归模型开发的公式可预测突变比例（MUT%），在训练集和验证集中准确率分别达88.00%和88.89%。例如，D94G突变的预测与ddPCR结果高度一致（Pearson r=0.97659），但痰液样本中高MUT%预测存在偏差（差异达20%-45%）。

讨论

MeltArray技术的核心优势在于：

1. 多突变解析能力：通过“荧光-T_m
   ”编码区分共突变，克服传统方法（如Xpert MTB/XDR）因T_m
   峰重叠导致的误判。
2. 低丰度检测：检出率显著优于Sanger测序（71.43% vs 98.57%），尤其对<20%的异质性耐药突变。
3. 快速临床转化：直接痰液检测缩短诊断时间，Cq≤35的质量控制阈值确保结果可靠性。

局限性包括痰液低载量样本的失败率（20%-30%）、5%以下异质性耐药漏检，以及痰液MUT%预测偏差。未来需优化DNA提取流程和算法模型。

结论

MeltArray MTB/FQs为FQs耐药性监测提供了高效、精准的一站式解决方案，其快速、灵敏的特性尤其适用于pre-XDR-TB的早期预警和个体化治疗决策。