热休克蛋白90（HSP90）分子伴侣活性是甲型肝炎病毒复制的关键因素

本研究颠覆了既往认为甲型肝炎病毒（HAV）复制不依赖热休克蛋白90（HSP90）的认知，通过化学抑制剂筛选、CRISPR筛选和蛋白质组学分析，证实HSP90β通过协助衣壳蛋白折叠和基因组复制双重机制促进HAV感染，且在体内模型中HSP90抑制剂17-AAG显著降低病毒载量。该发现为广谱抗病毒策略提供了新靶点。

　　

HSP90分子伴侣活性是甲型肝炎病毒复制的关键因素

ABSTRACT
热休克蛋白HSP90作为细胞蛋白稳态的核心调控因子，其ATP依赖的折叠功能对多种病毒蛋白成熟至关重要。尽管既往认为甲型肝炎病毒（HAV）是微小RNA病毒科中唯一不依赖HSP90的例外，本研究通过多维度实验证实：HAV在人类肝细胞系（IC₅₀
8.7-11.8 nM）和Ifnar1^-/-
小鼠模型中均高度依赖HSP90β活性。值得注意的是，HSP90抑制剂对HAV亚基因组复制子的强效抑制作用（IC₅₀
29.1 nM）揭示了其区别于其他微小RNA病毒的独特依赖性机制。

INTRODUCTION
热休克蛋白系统（HSP70/HSP90）通过协助客户蛋白折叠、复合体组装和配体结合，在病毒生命周期中发挥关键作用。尽管肠病毒、口蹄疫病毒等微小RNA病毒已被证实需要HSP90介导P1衣壳前体加工，HAV因其极端密码子偏好导致的慢速翻译特性，曾被推测可能通过共翻译折叠绕过该机制。然而，本研究通过化学遗传学筛选发现，HSP90抑制剂格尔德霉素（geldanamycin）在326种化合物库中表现出最强抗HAV活性，提示既往结论存在重大偏差。

RESULTS

HAV复制在肝癌细胞中依赖HSP90分子伴侣活性
化学筛选实验显示，格尔德霉素抑制Huh-7.5细胞中HAV 18f-NLuc报告病毒释放的IC₅₀
低至11.8 nM，远低于细胞毒性浓度（CC₅₀
333 nM）。CRISPR全基因组筛选进一步佐证：靶向HSP90β（HSP90AB1）的sgRNA显著富集，而HSP90α（HSP90AA1）未受影响。蛋白质组学分析发现，胞外准包膜病毒颗粒（eHAV）中HSP90β富集程度是HSP90α的4倍，与肠病毒71型（EV-A71）的HSP90β偏好性一致。

17-AAG在体内的抗病毒活性
在Ifnar1^-/-
小鼠模型中，HSP90抑制剂17-AAG（1 mg/天）处理使血清ALT活性降低47%，肝脏病毒RNA减少2.5个对数级。免疫组化显示，肝脏巨噬细胞浸润（IBA1⁺
细胞）面积缩小63%，证实HSP90抑制可同时阻断病毒复制和炎症损伤。

HAV复制周期中需要HSP90活性的关键步骤
时间梯度实验表明，HSP90抑制剂不影响病毒吸附/内化过程。令人惊讶的是，缺乏衣壳蛋白编码序列的HAV-FLuc亚基因组复制子对格尔德霉素高度敏感（IC₅₀
29.1 nM），而人鼻病毒B14（RV-B14）和帕雷霍病毒A1（PeV-A1）复制子则完全耐药。环状RNA报告系统证实HSP90不参与HAV IRES介导的翻译起始，且3C^pro
蛋白酶活性不受抑制剂影响。

HSP90相互作用蛋白的无标记定量蛋白质组学分析
免疫共沉淀-质谱鉴定出34个HAV衣壳蛋白衍生肽段（覆盖VP0/VP3/VP1pX），但未检测到任何非结构蛋白（P2P3区段）肽段。超分辨率显微镜显示，HSP90信号与dsRNA（复制细胞器标志物）重叠仅1.4%，而与未成熟VP1蛋白共定位达13%，提示其主要参与衣壳前体折叠。值得注意的是，ESCRT相关蛋白HD-PTP与HSP90的共定位在感染细胞中增加1.7倍，暗示HSP90可能协助准包膜病毒颗粒组装。

宿主细胞与HSP90相互作用的蛋白
在691个共沉淀宿主蛋白中，乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）表现最显著富集（P=1.6×10^-8
）。该HAV宿主因子是脂肪酸合成的限速酶，但格尔德霉素处理未导致ACC1降解，提示HSP90可能通过变构调节而非稳定性控制其功能。

DISCUSSION
本研究确立了HAV对HSP90β的双重依赖性：既需要其协助衣壳蛋白成熟（类似其他微小RNA病毒），又独特地依赖其支持RNA复制（可能通过ACC1调控）。FRhK4细胞中HSP90抑制剂的低效性（IC₅₀
804 nM）源于细胞类型特异性药物代谢差异，而非病毒特性。这些发现不仅修正了既往认知，更为开发靶向宿主HSP90的广谱抗病毒策略提供了理论依据。

MATERIALS AND METHODS
实验采用Huh-7.5.1、PH5CH8（MAVS/IRF1双敲除）等人源肝细胞系，通过RT-qPCR、纳米荧光素酶报告系统、Airyscan超分辨显微成像（63×油镜，Z轴分辨率180 nm）等技术完成验证。蛋白质组学数据经MaxQuant（v1.6.10.43）处理，采用双样本t检验（P<0.05）确定差异蛋白。