铜绿假单胞菌在金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌条件培养基中的进化蛋白质组学研究揭示多病原体共感染适应机制

本研究通过适应性实验室进化（ALE）结合蛋白质组学分析，揭示了铜绿假单胞菌（PA）在金黄色葡萄球菌（SA）和肺炎克雷伯菌（KP）条件培养基中的进化适应机制。研究发现进化菌株在生物膜形成、运动性、抗生素敏感性和细胞毒性等表型发生显著改变，并通过全基因组测序（WGS）鉴定出ampG、dipA等关键基因突变。特别揭示了T6SS（VI型分泌系统）不同亚型（H2/H3-HSI）的差异化调控模式，为理解临床多病原体共感染（如社区获得性肺炎）提供了新视角。

　　

铜绿假单胞菌的进化适应与多病原体互作机制

ABSTRACT
铜绿假单胞菌（PA）作为机会性病原体，常与金黄色葡萄球菌（SA）和肺炎克雷伯菌（KP）形成临床共感染。研究采用创新的上清液适应性进化（ALE）模型，通过15代培养循环使PA在SA和KP条件培养基（SASn/KPSn）中进化。与常规培养基进化的UmMd菌株相比，SASn/KPSn进化菌株表现出显著的表型变化：生物膜形成增强2-3倍，绿脓菌素产量提高1.5倍，而运动能力下降40-60%。全基因组测序发现进化菌株特有的非同义突变，包括调控应激反应的rpoS基因、影响β-内酰胺耐药性的ampG基因等。

INTRODUCTION
临床常见PA与SA/KP的共感染，但实验室难以维持稳定群落。前期研究多关注短期互作或生物膜模型，而本研究建立的"上清液-ALE"方法解决了这一技术瓶颈。PA通过T6SS、铁载体等机制与SA/KP互作，如PA分泌的HQNO可抑制SA电子传递，而在铁限制条件下又能通过鼠李糖脂生物表面活性剂排挤KP。

RESULTS

SASn-和KPSn-evolved strains displayed increased biofilm formation, increased pyocyanin production, and reduced motility
进化菌株表型分析显示：SASn和KPSn进化株生物膜形成量分别达到祖先株的2.3倍和1.8倍，而UmMd株降低30%。绿脓菌素产量在SASn/KPSn株中显著提升，与表型相关的dipA基因（调控生物膜分散）和bifA基因（影响鞭毛运动）发生功能缺失突变。运动性实验中，三种进化株的群游、泳动和抽搐运动均减弱，其中SASn株的抽搐运动面积减少达65%。

Whole-genome sequencing revealed nonsynonymous mutations in the evolved strains
基因组分析发现：SASn株在ampG（β-内酰胺信号转导）和dipA（生物膜调控）基因发生移码突变；KPSn株的anmK（肽聚糖代谢）和rpoS（应激反应）基因出现终止突变。值得注意的是，UmMd株积累了16个突变，远多于SASn/KPSn株（各3个），表明不同选择压力导致基因组进化轨迹分化。

Global analysis of protein regulation in the evolved PA strains
蛋白质组检测到3,890个蛋白，主成分分析显示SASn/KPSn株聚为一簇。差异表达蛋白（DEPs）分析发现：SASn株385个蛋白上调，203个下调；KPSn株434个上调，232个下调。功能富集显示T6SS效应蛋白Hcp、生物膜相关通路在SASn/KPSn株中共同上调，而UmMd株中下调。特别发现代谢通路在KPSn株显著上调，可能与anmK突变导致的生长缺陷补偿有关。

The proteomic profile comparison between different evolved strains
蛋白互作网络揭示：SASn株中O-抗原合成通路呈现A/B条带差异化调控——A条带合成蛋白（Rmd、Wzt）上调而B条带合成酶WbpM下调。T6SS亚型分析显示H2-HSI（含AmpDh3效应蛋白）在SASn/KPSn株中上调，而H3-HSI下调，这种"双刃剑"式调控可能增强对竞争菌的杀伤力。与预期相反，所有进化株中T6SS正调控因子MvfR均上调，提示存在新型调控机制。

SASn-和KPSn-evolved PA strains exhibited altered growth profiles and higher relative fitness compared to the ancestral and UmMd-evolved strains
生长曲线拟合显示KPSn株最大承载量（K值）降低15%，但竞争实验表明其相对适应性显著提升：与SA/KP共培养24小时后，SASn/KPSn株的竞争指数分别提高2.1倍和1.8倍。UmMd株虽K值略高，但竞争能力下降40%，印证了"生长-竞争"权衡进化策略。

The SASn and KPSn-evolved PA strains displayed increased cytotoxicity and decreased ampicillin sensitivity
细胞毒性实验显示：SASn/KPSn株感染HeLa细胞后LDH释放量比祖先株增加50-70%。药敏试验发现SASn株对氨苄青霉素敏感（抑菌圈直径15.98 mm），这与ampG突变导致的β-内酰胺酶诱导缺陷相符，而KPSn株因anmK突变未出现类似变化。

DISCUSSION
本研究突破传统共培养限制，通过上清液-ALE模型揭示PA的进化机制：1）SASn/KPSn株通过rpoS等突变重塑应激响应；2）T6SS的H2/H3亚型差异化调控可能是PA应对多物种竞争的特有策略；3）O-抗原合成重塑可能影响宿主免疫识别。与Tognon等报道的LPS缺陷表型不同，本研究发现A/B条带特异性调控，为PA血清型转换提供新线索。进化菌株增强的细胞毒性提示临床共感染可能加速PA毒力进化。

MATERIALS AND METHODS
实验采用PAO1野生株与MRSA ATCC 43300、KP NRRL-B-3521。上清液-ALE在含30%条件培养基的LB中进行15代（48h/代）传代。表型分析包括结晶紫染色（生物膜）、氯仿萃取（绿脓菌素）和三型运动实验。蛋白质组采用TimsTOF Pro质谱检测，数据通过NSAF值量化。竞争实验通过CFU对数比计算相对适应性，细胞毒性用LDH试剂盒检测。