基于大肠杆菌高效生物合成矢车菊素-3-O -葡萄糖苷的代谢工程策略及酶分子改造研究

针对微生物合成矢车菊素-3-O -葡萄糖苷（C3G）过程中UDP-葡萄糖（UDPG）供应不足和酶催化效率低等瓶颈问题，研究人员通过比较细胞二糖与蔗糖代谢路径、构建双顺反子表达系统、优化核糖体结合位点（RBS）及半理性设计糖基转移酶At 3GTL344V/F378G 突变体，最终实现1036.82 mg/L的C3G产量（转化率71.28%），为工业化生产高价值花青素奠定基础。

　　

花青素作为自然界最绚丽的天然色素之一，不仅赋予蓝莓、紫葡萄等果蔬迷人的色泽，更因其卓越的抗氧化能力和心血管保护作用被誉为"植物界的抗氧化剂之王"。其中矢车菊素-3-O
-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O
-glucoside, C3G）作为含量最丰富的花青素衍生物，在抗肿瘤、抗炎等领域展现出巨大应用潜力。然而传统植物提取法依赖有毒溶剂且收率低下，而微生物合成虽前景广阔，却受限于UDP-葡萄糖供给不足、酶催化效率低等瓶颈，此前报道的最高产量仅436 mg/L，远未达工业化需求。

为突破这一困境，国内研究人员在《Food Bioscience》发表研究，通过多维度工程改造大肠杆菌，构建了高效C3G生物合成体系。研究首先采用比较代谢策略，发现以纤维二糖为底物的UDPG合成路径比蔗糖路径效率提升4倍；继而创新性设计单顺反子、双顺反子和融合蛋白三种表达系统，证实双顺反子结构最利于平衡花青素合成酶（Ph
ANS）与糖基转移酶（At
3GT）的表达；通过RBS优化精细调控酶表达比例后，结合计算机辅助半理性设计获得At
3GT^L344V/F378G
突变体，其催化效率较野生型提升92.26%。最终在5L发酵罐中实现C3G产量1036.82±20.13 mg/L，创下大肠杆菌合成体系的最高纪录。

关键技术方法
研究整合了代谢流量分析（比较细胞二糖/蔗糖途径）、基因表达调控（双顺反子载体构建）、蛋白质工程（基于SwissModel同源建模和FoldX能量计算指导突变）及发酵工艺优化（DO-stat补料策略）。所有基因由天津通用基因技术公司合成，工程菌株基于E. coli BL21(DE3)构建。

研究结果

1. UDPG供给路径优化
   通过比较细胞二糖磷酸化酶（CBP）和蔗糖磷酸化酶（SP）两条UDPG合成路径，发现CBP途径使C3G产量提升至对照组的4倍，证实纤维二糖是更优的UDPG合成底物。

2. 表达系统构建
   设计三种Ph
   ANS/At
   3GT共表达方案：单顺反子、双顺反子（含内部核糖体进入位点）和融合蛋白系统。双顺反子结构以最小代谢负担实现最高C3G产量（较单顺反子提升58%），而融合蛋白因空间位阻导致活性下降。

3. RBS优化与酶平衡表达
   采用RBS Calculator v2.0设计不同翻译强度的RBS序列，将Ph
   ANS/At
   3GT表达比例调控至1:2.3时，C3G积累量达到峰值。

4. At
   3GT半理性设计
   基于催化口袋残基进化保守性分析，对L344/F378等6个位点进行饱和突变，获得双突变体At
   3GT^L344V/F378G
   ，其k_cat
   /K_m
   值提升1.9倍，分子动力学模拟显示突变扩大了底物结合通道。

5. 发酵工艺放大
   在DO-stat补料发酵中优化诱导时机（OD₆₀₀
   =35）和温度（28℃），最终产量突破1g/L大关，底物转化率达71.28%±0.01%。

结论与意义
该研究通过"代谢路径-表达系统-酶分子"三级优化策略，首次将大肠杆菌合成C3G的产量推升至工业化可行水平。特别值得注意的是：①细胞二糖路径的优越性揭示了旁路代谢对天然产物合成的关键作用；②双顺反子表达系统为多酶协同表达提供了新范式；③At
3GT^L344V/F378G
突变体的发现开辟了糖基化修饰工程的新靶点。这项成果不仅为高附加值花青素的绿色制造提供解决方案，其方法论对其它植物次级代谢产物的微生物合成具有重要借鉴价值。