CD109冷冻电镜结构揭示其蛋白酶抑制机制及构象重排的分子基础

（编辑推荐）本研究通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了GPI锚定蛋白CD109的天然态、蛋白酶激活态（CD109P）和甲基胺激活态（CD109MA）的三维结构，揭示了其通过硫酯（TE）共价结合蛋白酶并依赖N-糖基化（N-linked glycans）实现底物空间屏蔽的抑制机制，为理解α-巨球蛋白（αM）家族单体成员的保守功能模式提供了结构基础。

　　

引言

CD109是一种160 kDa的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白，广泛表达于T细胞、角质细胞和血小板等细胞膜表面。它既是转化生长因子β（TGF-β）信号通路的共受体，又能通过独特的“诱饵区（BR）切割-硫酯暴露-蛋白酶共价捕获”机制抑制多种蛋白酶活性。CD109的缺失会导致小鼠皮肤增生和骨质疏松样表型，并与癌症、慢性炎症和血小板减少症相关。

天然CD109的结构特征

冷冻电镜解析的天然CD109结构（3.0 ?分辨率）显示其由MG1-6结构域组成的环形框架（MG环）和C端CUB-TE-MG8结构域模块构成。硫酯键（Cys921-Gln924）深埋于MG8域的疏水核心中，而动态的诱饵区（Tyr650-Lys688）穿过MG2-MG3连接环（MG23L通道）。与同家族蛋白A2ML1相比，CD109的MG环弯曲程度更高，且C端特有的“锚定区”（含二硫键）通过非共价相互作用稳定MG7-MG8界面。

糖基化的功能调控

质谱鉴定出CD109的10个N-糖基化位点，其中Asn1086、Asn1244和Asn1355的糖链可能调控膜取向。GlycoSHIELD模拟显示，MG1/MG3附近的糖基（Asn118/Asn337）通过空间位阻限制诱饵区构象，影响蛋白酶特异性。实验证实，去糖基化虽不影响糜蛋白酶（chymotrypsin）与TE的共价结合，但使底物（明胶）水解活性抑制率从60%降至30%，说明糖链通过物理屏蔽增强蛋白酶抑制效果。

蛋白酶激活的构象变化

插入TEV蛋白酶切割位点的CD109变体（CD109P）在BR切割后，C端残基（BR-C）从MG3面回缩至MG6面，触发MG7结构域旋转及TE-CUB模块40 ?位移，形成蛋白酶容纳裂隙。该构象与A2ML1高度相似（RMSD 1.45 ?），且保守疏水核心（如Phe1252-Ile1162）维持TE-CUB界面稳定性。释放的MG8-锚定区片段证实了生理条件下CD109的膜解离机制。

甲基胺激活的中间态特征

甲基胺（MA）直接攻击TE键诱导的CD109MA构象与CD109P整体相似，但因未切割的BR阻塞MG23L通道，MG3域旋转滞后20°。生物层干涉实验显示，MA激活（t_1/2
=12 min）显著慢于蛋白酶切割（t_1/2
=1.4 min），表明天然态中TE的可及性决定激活速率差异。

进化保守的锚定区

比较结构学分析发现，CD109和蚊子Tep1r的锚定区均含双二硫键，并通过类似模式与MG7相互作用。AlphaFold3预测该特征存在于早期后生动物（如丝盘虫）的CD109样蛋白中，提示其在αM家族功能演化中的关键作用。

疾病相关突变与展望

CD109的Y703S多态性（Gov抗原）位于MG6表面保守区，虽不影响蛋白酶抑制，但可能干扰未知蛋白互作。研究为开发靶向CD109-TGF-β/STAT3交叉网络的疗法提供了结构模板，并阐明单体αM成员通过“糖基化增强的空间屏蔽”弥补其较四聚体（如A2M）更弱的蛋白酶捕获效率这一进化策略。

（注：全文严格依据原文实验数据及结论归纳，未添加非文献支持内容。）