基于RNase HII水解的LAMP-LFSA联用技术：一种快速精准的类鼻疽伯克霍尔德菌床旁检测新策略

这篇研究创新性地将环介导等温扩增(LAMP)技术与侧向流动试纸条(LFSA)结合，并引入RNase HII水解探针系统，开发出RCDP-LAMP检测平台。该方法针对类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)的保守序列设计特异性探针，通过实时荧光或试纸条可视化读取结果，检测限达50 fg/反应，兼具高灵敏度、强特异性与操作便捷性，为热带地区类鼻疽病的早期诊断和大规模筛查提供了突破性解决方案。

　　

原理与技术创新

RNase HII介导的双功能探针LAMP(RCDP-LAMP)技术通过三重机制确保检测特异性：正向内引物(FIP)与反向内引物(BIP)实现靶序列的指数级扩增；外引物(F3/B3)介导链置换反应形成哑铃状产物；核心创新点在于设计的探针在5'端标记FAM荧光基团，3'端连接生物素(Biotin)，中间插入BHQ1淬灭基团，并将第八位鸟苷酸替换为核糖核苷酸(rG)。当探针与靶序列杂交时，RNase HII特异性切割rG位点，使FAM与BHQ1分离产生荧光信号，同时释放的生物素端可用于LFSA捕获。这种双信号输出系统突破了传统LAMP假阳性高的瓶颈。

实验优化与性能验证

通过系统优化反应条件，确定最佳体系为：7.5 mM Mg²⁺
、8 U Bst 2.0 DNA聚合酶、200 nM探针与40 mU RNase HII的1:5配比，60°C反应30分钟即可完成检测。灵敏度测试显示，该方法对B. pseudomallei基因组DNA的检测下限达50 fg/反应，标准曲线TTR=-4.674×lg(C)+37.29(R2=0.979)呈现优异线性关系。特异性实验中，与肺炎克雷伯菌(K. pneumonia)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)等近缘菌株均无交叉反应，特别是能准确区分同属的洋葱伯克霍尔德菌(B. cepacia)，这对临床鉴别诊断至关重要。

临床应用与现场检测

在20例临床分离株验证中，所有B. pseudomallei样本均显示典型扩增曲线，LFSA试纸条的"检测线"(T线)与"质控线"(C线)比值稳定。该平台突破传统PCR对精密仪器的依赖，仅需普通恒温设备即可完成操作，反应产物通过试纸条2-5分钟即可肉眼判读，完美适配基层医疗场景。研究特别指出，在海南等热带地区，极端天气导致病原体从30 cm深土壤层扩散至地表时，这种快速检测对暴发疫情筛查具有重大实践价值。

技术优势与转化前景

相比传统培养法(耗时3-7天)和免疫检测(灵敏度不足)，RCDP-LAMP将检测周期压缩至1小时内，且无需复杂样本前处理。其创新性体现在：1) RNase HII介导的探针切割机制有效抑制非特异性扩增；2) 双信号输出既兼容实验室荧光定量又支持现场试纸条判读；3) 成本仅为常规分子检测的1/5。该技术为WHO认定的"被忽视热带病"——类鼻疽病提供了首个兼具POCT适用性与实验室精度的解决方案，尤其适合资源有限地区的分级诊疗体系。未来通过优化直接血样检测功能，有望进一步推动该技术在急诊和野外防控中的应用。