基于异肽键模拟物(IsoMim)的荧光偏振去泛素化检测技术开发及其在DUB抑制剂高通量筛选中的应用

本研究针对去泛素化酶(DUBs)活性检测试剂制备复杂、通量低的问题，开发了基于异肽键模拟物(IsoMim)的荧光偏振(FP)检测新方法。通过重组表达Ub-GGGC-FM和DiUb3G -FM探针，成功实现对USP4/USP15/UCHL3等DUB家族成员的活性区分及PR-619抑制剂的pIC50 测定，其高通量筛选适用性为DUB靶向药物开发提供了重要工具。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，泛素-蛋白酶体系统如同一个高效的"分子垃圾处理厂"，通过给目标蛋白贴上泛素标签来决定其命运。去泛素化酶(DUBs)作为这个系统的关键"质检员"，能够逆向移除泛素标签，从而调控蛋白质稳定性、定位和功能。这类酶与癌症、神经退行性疾病和免疫疾病密切相关，已成为极具潜力的药物靶点。然而长期以来，DUB活性检测面临两大技术瓶颈：天然异肽键底物难以获取，现有荧光底物如Ub-AMC需要复杂的多步合成且产率低下，严重制约了DUB机制研究和抑制剂开发进程。

针对这一挑战，研究人员开发了一种创新的荧光偏振检测技术——IsoMim assay。该技术的核心突破在于设计出含有GGGC延伸序列的泛素模拟探针（Ub^3G
-FM和DiUb^3G
-FM），通过重组表达即可高效制备。当DUB切割探针释放荧光基团时，分子旋转速度变化导致荧光偏振信号改变，从而实现酶活性的实时监测。这种设计巧妙模拟了天然异肽键的空间构象，其制备过程仅需在泛素C端引入三个甘氨酸和半胱氨酸后进行荧光标记，产量可达6-8mg/L培养液，远高于传统方法。

研究团队运用分子克隆技术构建了Ub^L73P
-Ub-GGGC等重组质粒，通过镍柱亲和层析和分子筛纯化获得高纯度蛋白。荧光偏振检测在384孔板中进行，采用495nm激发光有效规避化合物自发荧光干扰。为验证技术普适性，研究人员系统测试了USP2、USP4、UCHL3等不同DUB家族成员，并通过SDS-PAGE和荧光扫描确认探针的特异性切割。

研究结果显示，该技术能清晰区分不同DUB的活性特征：USP2表现出最高活性（100nM时速率达13.68mP/min），UCHL3次之，而OTUB1则完全不识别该探针，这与各类DUB已知的底物偏好性高度一致。特别值得注意的是，竞争实验揭示了USP家族成员间的细微差异——USP4和USP11受产物泛素抑制，而USP15则对缺失C端双甘氨酸的泛素变体（UbΔGG）更敏感，暗示其底物识别机制存在独特性。

在应用转化方面，该技术成功测定了广谱抑制剂PR-619对USP4（pIC₅₀
6.33）、USP15（pIC₅₀
6.23）等的抑制效力，并通过"伪高通量筛选"验证了其HTS适用性（Z'因子0.7-0.9）。与传统Ub-AMC法相比，IsoMim assay仅需10nM探针浓度即可获得可比数据，大幅降低试剂消耗。

这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究具有多重创新价值：技术上，首次实现DUB底物的规模化重组生产，解决了传统方法产率低、成本高的痛点；科学上，为解析DUB家族成员间的底物选择性差异提供了新工具；应用上，其高通量兼容性为加速DUB靶向药物开发铺平道路。未来通过替换不同荧光基团或延伸至SUMO等泛素样修饰系统，该技术平台还有望拓展更广阔的应用场景。正如研究者所言，这项突破不仅填补了DUB研究领域的关键技术空白，更可能成为推动相关靶向疗法开发的"游戏规则改变者"。