拓扑异构体在伤口愈合肽GRN-P4A中的结构解析与生物活性调控机制

本研究针对富含二硫键肽（disulfide-rich peptides）氧化折叠过程中拓扑异构体（topological isomers）的形成机制及其对生物活性的影响展开研究。通过RP-HPLC分离、NMR结构解析和分子动力学模拟，首次在GRN-P4A中发现两种非互变的拓扑异构体，其差异源于Pro2 构象限制导致的Loop 1空间取向不同。实验证实异构体2（EC50 =93 nM）比异构体1具有更强的LX-2细胞增殖活性，为优化伤口愈合肽设计提供了新思路。

　　

在生物医药领域，富含二硫键的肽类（disulfide-rich peptides）因其独特的结构稳定性和多样的生物活性，已成为治疗药物开发的热点。然而，这类肽在合成过程中复杂的氧化折叠机制常导致多种异构体产生，其中拓扑异构体（topological isomers）——具有相同二硫键连接方式但三维构象不同的变体——对生物活性的影响长期未被充分认知。尤其令人困惑的是，为何某些拓扑异构体在生理条件下不会相互转化？这种构象差异又如何精确调控其治疗效能？

针对这一科学难题，詹姆斯库克大学的研究团队以具有显著促伤口愈合活性的GRN-P4A肽（源自肝吸虫granulin家族生长因子Ov-GRN-1的工程化变体）为模型，通过多学科交叉研究揭示了拓扑异构体的形成机制与功能差异。该成果发表于《Journal of Biological Chemistry》，为理性设计治疗性肽提供了全新视角。

研究采用固相肽合成（SPPS）制备线性GRN-P4A，通过空气氧化获得四种异构体，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化。结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）验证分子量后，采用核磁共振（NMR）技术（包括TOCSY、NOESY、HSQC等）解析空间结构。通过AlphaFold3预测和分子动力学（MD）模拟辅助验证，并采用xCELLigence实时细胞分析系统检测异构体对肝星状细胞（LX-2）增殖的影响。

GRN-P4A氧化与纯化
氧化反应产生四个主要异构体（按洗脱顺序命名为1-4），其中异构体2占比60%。MALDI-TOF MS确认均为完全氧化形式，MS/MS碎片模式显示异构体1与2、3与4分别具有结构相似性。

NMR结构解析
异构体1和2显示出良好的β-折叠结构，而3和4呈现无序状态。关键发现是：尽管异构体1和2具有相同的二硫键连接（Cys^I
-Cys^III
/Cys^II
-Cys^V
/Cys^IV
-Cys^VI
），但Pro²
构象差异导致Loop 1呈现右手螺旋（异构体1）和左手螺旋（异构体2）两种不可互变的拓扑结构。这种差异通过双套索结（DLK）结构稳定存在。

AlphaFold预测局限
AlphaFold3虽正确预测二硫键连接，但Loop 1构象仅匹配低丰度异构体1，未能反映实际存在的拓扑异构现象。

Pro²
的关键作用
将Pro²
替换为Gly的突变体（GRN-L1m）仅产生单一氧化产物，证实Pro的构象刚性是拓扑异构体形成的决定性因素。

生物活性差异
异构体2展现最强促增殖活性（EC₅₀
=93 nM），而异构体1在400 nM浓度下仍无显著效应。突变体GRN-L1m活性降低（EC₅₀
=318 nM），证实Loop 1构象精确调控生物功能。

分子动力学验证
200 ns模拟显示异构体1的Loop 1/3柔性更高，而异构体2结构更稳定，与其生物活性差异相吻合。

这项研究首次在实验层面证实：富含二硫键肽可通过局部构象差异（如Pro诱导的Loop取向变化）形成稳定的拓扑异构体，这些构象"冻结"状态直接决定其治疗效能。特别值得注意的是，占氧化产物主体的异构体2恰好是生物活性最优形式，这种自然选择倾向为药物开发提供了重要启示。研究同时指出，当前AI预测工具（如AlphaFold）尚无法捕捉这类精细构象变化，强调实验结构解析的必要性。

从转化医学角度看，该发现对GRN-P4A作为伤口愈合剂的产业化具有双重意义：一方面需优化纯化工艺以确保活性异构体2的主导地位；另一方面可通过定向改造Pro位点减少异构体复杂性。更广泛地说，这种"拓扑异构-功能调控"的新机制为理解其他富含二硫键肽（如神经毒素、抗菌肽）的结构-活性关系提供了范式，开辟了通过构象工程精确调控肽类药物效能的创新路径。