活细胞成像揭示hiPSCs神经分化过程中DNA损伤与细胞周期进程的差异性响应机制

本研究通过开发新型"Focicle"活细胞成像系统，解决了干细胞分化状态如何影响DNA损伤应答（DDR）的关键科学问题。研究人员将53BP1 foci形成区域与荧光泛素化细胞周期指示器（hCdt1/hGmnn）整合到人诱导多能干细胞（hiPSCs）中，发现神经分化过程中53BP1 foci积累动力学和细胞周期调控存在显著差异：hiPSCs表现出缓慢的53BP1募集而神经前体细胞（hNPCs）和成熟神经元（hNeurons）呈现快速响应。该成果为理解器官发育中基因组稳定性维持机制提供了重要工具。

　　

在生命科学领域，干细胞如何维持基因组稳定性始终是核心难题。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）因其独特的自我更新能力和分化潜能，在再生医学中具有广阔前景，但其短暂的G₁
期会导致复制压力增加，而分化过程中DNA损伤应答（DDR）的动态变化机制尚不明确。更棘手的是，传统检测方法无法实时观测活细胞中DNA修复与细胞周期的协同调控。这些空白严重制约着干细胞临床应用的安全性评估。

针对这一系列挑战，国内研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表创新性研究。他们巧妙改造了先前开发的"Focicle"系统——这是一种将53BP1（p53结合蛋白1）损伤标志物与荧光泛素化细胞周期指示器（hCdt1标记G₁
期，hGmnn标记G₂
/M期）整合的活细胞成像技术。通过piggyBac转座子系统将其适配到人源细胞，建立了Focicle-hiPSCs模型，并进一步分化获得神经前体细胞（hNPCs）和成熟神经元（hNeurons）。研究采用激光显微照射诱导DNA双链断裂（DSBs），结合γ-H₂
AX、RAD51等免疫标记，系统比较了不同分化阶段的DDR特征。

关键技术包括：1）构建含人源53BP1 foci形成区域（FFR）的piggyBac载体；2）流式细胞术分析细胞周期分布；3）405nm激光显微照射实时追踪53BP1募集动力学；4）免疫荧光定量HR/NHEJ修复效率。

研究结果揭示多个重要发现：

功能验证
在RPE1-hTERT细胞中，改造后的hFocicle系统成功实现53BP1 foci与细胞周期标志物的共定位。辐照后1小时即可检测到典型53BP1 foci，且hCdt1⁺
/hGmnn^-
细胞占比50.33%，符合体细胞特征。

神经分化模型建立
从Focicle-hiPSCs分化的hNPCs高表达SOX2和nestin，神经元则呈现MAP2/Tuj1阳性。分化后G₁
期细胞比例从hiPSCs的4.56%显著提升至hNPCs的19.93%，说明分化延长了G₁
期。

修复通路差异
同源重组（HR）标志物RAD51 foci在hiPSCs中丰富但在hNPCs中减少，神经元几乎缺失；而非同源末端连接（NHEJ）相关pDNA-PKcs在hNPCs中修复更快。激光照射显示53BP1在神经元中1分钟即达峰值并持续稳定，而hiPSCs需5分钟且积累量更低。

G₁
期保护机制
辐照24小时后，hiPSCs中hCdt1⁺
细胞比例增至13.83%，并特异性地形成53BP1核体（NBs），提示延长G₁
期可能通过NHEJ保护未修复损伤。

讨论部分指出，该研究首次揭示hiPSCs通过独特的53BP1NB机制协调基因组维护与多能性保持。不同于快速修复的终末分化细胞，hiPSCs倾向于将损伤细胞阻滞在G₁
期，这种"质量控制系统"可能避免突变累积。研究建立的hFocicle技术平台为器官发育中的DDR研究提供强大工具，对优化干细胞治疗策略具有重要指导意义。尤其发现hiPSCs中53BP1募集效率低于分化细胞，颠覆了"干细胞必然具有高效修复"的传统认知，提示其高表达的修复因子可能主要用于应对内源性复制压力。这些发现为理解组织特异性基因组维护机制开辟了新视角。