KRAS开关II口袋抑制剂的生物物理与结构分析揭示等位基因特异性结合限制

研究人员针对KRAS突变在多种癌症中的关键作用，开展了一项关于KRAS开关II口袋(S-II pocket)抑制剂的系统性研究。通过比较共价和非共价抑制剂对不同KRAS突变体的结合亲和力，发现Q61R突变体因形成额外氢键导致S-II口袋可及性降低。该研究为开发新一代等位基因特异性和泛KRAS小分子抑制剂提供了重要结构依据。

　　

KRAS基因突变在20%的人类癌症中被发现，尤其在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中高度突变。尽管KRAS长期以来被认为是"不可成药"靶点，但近年来针对KRAS G12C突变的共价抑制剂取得突破性进展。然而，KRAS不同突变体对药物的响应存在显著差异，且活性GTP结合状态的靶向仍具挑战性。这些问题的解决亟需深入理解KRAS抑制剂的结合机制和结构基础。

为回答这些问题，国外研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表了一项系统性研究。研究人员采用表面等离子共振(SPR)、微尺度热泳动(MST)、X射线晶体学和均相时间分辨荧光(HTRF)等技术，比较了包括AMG510、MRTX849、BBO8520等在内的多种KRAS抑制剂对7种致癌突变体(KRAS G12C、G12D、G12V、G13D、Q61H、Q61R和A146T)的结合特性。研究特别关注了这些化合物在GDP和GppNHp(非水解GTP类似物)结合状态下与KRAS的相互作用。

在"RAF1 RBD与KRAS突变体结合亲和力"部分，研究发现所有KRAS突变体与RAF1-RBD的结合亲和力(K_D
)与野生型相比差异在2倍以内，但Q61R和A146T分别表现出2.3倍和3.6倍的亲和力减弱。这提示不同突变可能通过影响switch-I构象动态来调节效应蛋白结合。

"KRAS G12C共价修饰动力学"研究显示，BBO8520对KRAS-G12C-GDP的亲和力(K_D
1.4 nM)比早期化合物AMG510(K_D
1.0 mM)提高了近6个数量级。共价反应速率常数(k_inact
/K_i
)分析表明，BBO8520对GDP结合态的修饰效率显著高于GTP结合态。

"核苷酸依赖性结合"部分揭示了S-II口袋抑制剂普遍存在"活性状态惩罚"现象。例如MRTX1133对KRAS-GDP和KRAS-GppNHp的K_D
分别为790 pM和16 nM，亲和力下降约20倍。晶体结构分析表明，G60与γ-磷酸的氢键在活性状态下稳定了switch-II构象，限制了S-II口袋的可及性。

特别值得注意的是"致癌等位基因特异性结合"的发现。Q61R突变在GppNHp状态下会形成独特的氢键网络：R61不仅与T35主链羰基形成氢键，还通过水分子与γ-磷酸产生相互作用。这种结构特征导致S-II口袋抑制剂对KRAS Q61R-GppNHp的结合亲和力降低5-10倍，主要反映在结合速率(k_on
)的显著减慢。

在"KRAS:RAF1相互作用抑制"实验中，MRTX1133表现出最强的抑制活性(IC₅₀
114 nM)，且抑制效力与SPR测得的结合亲和力高度相关(Spearman相关系数>0.89)。这证实S-II口袋结合通过稳定switch-I的"状态1"构象来阻断效应蛋白识别。

这项研究的重要意义在于：首先，通过系统比较不同结构类型抑制剂的结合特性，建立了KRAS靶向化合物的结构-活性关系；其次，发现Q61R突变特有的结构特征为开发等位基因特异性抑制剂提供了新思路；最后，阐明活性状态结合挑战的分子基础，为设计靶向KRAS-GTP的下一代抑制剂指明方向。这些发现不仅推动KRAS靶向治疗的发展，也为研究其他"不可成药"靶点提供了方法论参考。