HLA-DR4递呈瓜氨酸化肌腱蛋白-C的T细胞受体识别分子机制及其在类风湿关节炎中的意义

研究人员针对类风湿关节炎(RA)中CD4+ T细胞对HLA-DRB1递呈的瓜氨酸化(cit)自身表位的自身反应性机制，聚焦TNC1014,1016cit 肽段（含P-1和P2位双瓜氨酸化）与HLA-DRB1 * 04:01的分子互作。通过晶体结构解析（2.4-3.2 ?）发现TRAV35+ /TRBV10-2+ PB TCR通过CDR3α螺旋构象特异性识别双瓜氨酸位点，表面等离子共振(SPR)和CD69激活实验证实其严格特异性。该研究为RA中瓜氨酸化修饰调控TCR识别提供了新见解。

　　

类风湿关节炎(RA)是一种以关节慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，全球约0.5%人口受累。该疾病最显著的标志是患者血清中存在抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)，超过70%的RA患者在疾病发生前或确诊时呈现ACPA阳性。瓜氨酸化是一种由肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD)催化的翻译后修饰(PTM)，将带正电荷的精氨酸转化为中性的瓜氨酸，导致新抗原产生和自身免疫原性。遗传学研究显示，RA易感性与HLA-DRB1基因座密切相关，特别是携带共享易感表位(SE)的等位基因，其中HLA-DRB1 * 04:01在欧洲人群中具有最高风险（比值比OR=4.44）。

尽管目前已阐明T细胞受体(TCR)对瓜氨酸化纤维蛋白原(cit-fibrinogen)、瓜氨酸化波形蛋白(cit-vimentin)和瓜氨酸化α-烯醇化酶(cit-α-enolase)表位的识别机制，但对其他瓜氨酸化表位（如肌腱蛋白-C(TNC)）的识别方式以及不同瓜氨酸化位点如何调控T细胞识别仍不清楚。这成为理解RA发病机制的关键科学问题。

针对这一知识空白，来自瑞典卡罗林斯卡医学院等机构的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表了重要研究成果。研究人员选择含有P-1和P2位双瓜氨酸化的TNC^1014,1016cit
肽段（序列¹⁰¹³
DcitYcitLNYSLPTG¹⁰²⁴
）作为研究对象，从RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中分离出TRAV35⁺
/TRBV10-2⁺
(PB) TCR克隆，综合运用X射线晶体学（分辨率2.4-3.2 ?）、表面等离子共振(SPR)、四聚体染色和CD69激活实验等技术，系统揭示了TCR识别双瓜氨酸化表位的分子机制。

关键技术方法包括：1) 从RA患者PBMC中分离HLA-DRB1 * 04:01-TNC^1014,1016cit
四聚体阳性T细胞克隆；2) 通过HEK293T细胞瞬时表达和原核表达系统获得PB TCR蛋白；3) 利用荧光偏振法测定TNC肽与不同HLA-DRB1变体的结合亲和力；4) 结晶并解析HLA-DRB1 * 04:01^{TNC1014,1016cit}
二元复合物(2.4 ?)和PB TCR-HLA-DRB1 * 04:01^{TNC1014,1016cit}
三元复合物(3.2 ?)结构；5) 采用SPR分析TCR-pMHC II相互作用动力学；6) 通过丙氨酸扫描突变鉴定关键相互作用残基。

HLA-DRB1 * 04:01^{TNC1014,1016cit}
的晶体结构显示，该肽段以典型结合模式占据HLA-DRB1 * 04:01肽结合槽，P-1和P2位的两个瓜氨酸均向外突出。与已报道的HLA-DRB1 * 04:01-肽结构相比，TNC^1014,1016cit
保持了保守的P1-Tyr和P4-Asn锚定模式。静电表面分析显示，双瓜氨酸化使肽段P-1和P2位呈现中性电荷特征，与天然肽段（含带正电精氨酸）形成鲜明对比，这可能是影响TCR特异性的关键因素。

在抗原特异性方面，TRAV35⁺
/TRBV10-2⁺
PB TCR仅特异性识别HLA-DRB1 * 04:01递呈的TNC^1014,1016cit
，而对其他RA自身抗原（cit-vimentin、cit-α-enolase和cit-fibrinogen）无交叉反应。SPR分析显示PB TCR与双瓜氨酸化表位的结合亲和力(KD=25.8 μM)显著高于单瓜氨酸化变体（TNC^1016cit
的KD=50 μM），且完全不识别天然TNC^1013-24
肽段。CD69激活实验证实，低至0.32 ng/mL的TNC^1014,1016cit
即可显著激活PB TCR转导的SKW3 T细胞，表明其高度敏感性。

结构生物学分析揭示了独特的识别机制：PB TCR以约70°角度结合肽段中央区域，其中CDR3α环(¹⁰⁹
VGNTN¹¹³
)形成次级螺旋构象覆盖肽段N端。与未结合状态相比，CDR3α在结合后发生显著的构象重排，Val¹⁰⁹
插入两个瓜氨酸之间形成疏水相互作用。这种构象变化直接驱动了P2-Cit约40°的位移，使Thr¹¹²
和Asn³⁷
能够与P2-Cit形成氢键。此外，P5-Tyr与CDR3β的Pro¹¹⁰
和Val¹⁰⁹
形成广泛接触，共同构成"三足鼎立"的特异性识别模式。

通过丙氨酸扫描突变，研究人员鉴定出CDR3α-Asn¹¹³
、CDR1β-Tyr³⁸
和CDR3β-Val¹⁰⁹
/Pro¹¹⁰
等残基对结合具有决定性影响（>10倍亲和力降低）。值得注意的是，尽管TNC^1014,1016cit
在P4位为Asn而非Cit，但SE残基（特别是Gln⁷⁰
和Lys⁷¹
）仍通过共同识别P4-Asn和TCR CDR环，维持了与其他cit-表位类似的"双识别"模式。这种保守性提示SE在塑造TCR库选择中的普适性作用。

在临床相关性方面，研究发现TNC^1014,1016cit
可被多种SE⁺
HLA-DRB1变体（*01:01、04:01和14:02）有效递呈，但对HLA-DRB1 * 04:04结合极弱（IC₅₀

300 μM），这归因于P1口袋Val⁸⁶
导致的立体阻碍。有趣的是，PB TCR能交叉识别HLA-DRB1 * 04:05递呈的表位（KD=75.5 μ