真菌生物碱zinnimidine的完整生物合成：异吲哚酮核心形成的生化机制解析

本研究针对真菌异吲哚酮类天然产物的核心结构形成机制不明的问题，通过基因组挖掘和异源表达技术，系统解析了植物毒素zinnimidine的生物合成途径，揭示了关键氧化还原酶ZinD催化邻苯二甲醇转化为邻苯二醛并自发形成异吲哚酮核心的分子机制，为真菌次级代谢产物的生物合成提供了新见解。

　　

在真菌天然产物中，异吲哚酮（isoindolinone）骨架因其广泛的生物活性和药物开发潜力备受关注。然而，这类核心结构的生物合成机制长期未被阐明，特别是从简单芳香前体到异吲哚酮的关键转化步骤存在理论空白。来自中国科学院的研究团队以植物病原真菌Alternaria alternata产生的植物毒素zinnimidine为研究对象，通过多学科交叉方法揭示了这一重要科学问题。

研究团队首先通过基因组挖掘技术锁定了包含非还原性聚酮合酶（nrPKS）的zin基因簇。利用Aspergillus nidulans异源表达系统，成功鉴定出zinnimidine及其前体化合物3-甲基orsellinic acid（3）。通过整合酵母和大肠杆菌表达、体外酶活实验及化学喂养实验，逐步解析了从聚酮前体3到终产物zinnimidine的完整生物合成途径。

关键技术包括：1）基于cblaster工具的基因组聚类分析；2）A. nidulans和Saccharomyces cerevisiae异源表达系统；3）体外酶催化反应与H₂
O₂
检测；4）核磁共振（NMR）和质谱（HR-MS）结构解析；5）密度泛函理论（DFT）计算验证结构。

基因组挖掘与异吲哚酮生物合成基因簇鉴定
通过比较基因组学发现，zin基因簇包含编码nrPKS ZinH、P450酶ZinA和氧化还原酶ZinD等关键酶。异源表达实验证实该簇负责产生zinnimidine（1）及其中间体3-6，其中nrPKS ZinH单独表达即可合成起始单元3。

Zinnimidine生物合成的生化重建
研究发现NRPS-like蛋白ZinF通过A-T-R结构域将羧酸3还原为醛7；甲基转移酶ZinB催化7的4-O-甲基化形成8；短链脱氢酶ZinE将8还原为9；P450酶ZinA进一步羟基化C2-甲基生成关键中间体4。预酰基转移酶ZinC将4转化为5，而ZinE的逆反应可催化5生成异苯并呋喃酮6和10。

ZinD的催化机制与应用拓展
核心发现是黄素依赖型氧化还原酶ZinD催化5的邻苯二甲醇氧化为高活性邻苯二醛中间体，在氨存在下自发形成异吲哚酮核心。实验证实该过程伴随H₂
O₂
产生，且能利用不同氨基酸合成新型异吲哚酮衍生物14-19。

异吲哚酮生物合成基因簇的进化分析
cblaster分析显示ZinADEF在Eurotiomycetes等多类真菌中高度保守，表明其介导的异吲哚酮形成机制在真菌界普遍存在。

这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究首次完整阐明了真菌异吲哚酮骨架的生物合成机制，揭示了ZinD催化的氧化-胺化级联反应是该类化合物结构多样化的关键。研究不仅为理解真菌次级代谢的进化提供了新视角，建立的酶催化平台还可用于设计新型异吲哚酮衍生物。在应用层面，解析植物毒素zinnimidine的合成途径为开发靶向生物防治策略奠定了理论基础。