上游工艺参数对单链抗体片段包涵体特性及重折叠得率的影响机制研究

本研究针对上游工艺(USP)参数(比底物摄取率qS 和诱导温度)如何影响单链抗体片段(scFvM)包涵体(IBs)的滴度、纯度、尺寸、二级结构及重折叠得率(RY)这一关键问题，通过实验设计(DoE)系统分析。研究发现USP条件仅显著改变IBs滴度(最高达3.91 g/L)，而对其余特性无统计学影响，为单纯IBs形成蛋白的工艺优化提供了新视角，成果发表于《Journal of Biotechnology》。

　　

在生物制药领域，大肠杆菌(E. coli)表达系统因其成本低、易操作等优势，成为重组蛋白生产的首选平台。然而，当目标蛋白以不溶性包涵体(Inclusion Bodies, IBs)形式存在时，必须通过复杂的重折叠(refolding)步骤恢复其天然活性——这一过程不仅耗时耗力，且得率往往难以预测。更令人困扰的是，目前科学界对上游培养条件(如温度、底物供给速率等)如何影响IBs的物理化学特性及其后续重折叠效率，仍缺乏系统认知。这种知识空白严重制约了生产工艺的理性优化，特别是对于单链抗体片段(single-chain variable fragment, scFv)这类具有重要治疗价值的蛋白质。

针对这一瓶颈问题，来自国内某研究机构的研究团队以scFvM为模型蛋白，开展了一项创新性研究。他们采用实验设计(Design of Experiment, DoE)方法，系统考察了比底物摄取率(q_S,initial
)和诱导温度这两个关键上游工艺(Upstream Processing, USP)参数对IBs多维度特性的影响。令人意外的是，与既往文献报道不同，研究发现这些USP参数虽然能显著改变IBs滴度(通过响应面模型优化最高可达3.91 g/L)，但对IBs的纯度(平均91.7%)、粒径(平均429 nm)、二级结构(80%为β-折叠)以及重折叠得率(refolding yield, RY)(平均57%)均无统计学显著影响。这一发现颠覆了"USP条件可普遍调控IBs性质"的传统认知，为单纯形成IBs的蛋白质提供了明确的工艺优化方向——即聚焦于滴度最大化而非结构调整。该突破性成果发表于生物技术领域权威期刊《Journal of Biotechnology》。

研究团队运用了多项关键技术：1) 采用BL21(DE3)/pET30a(+)系统进行可控表达；2) 通过设计空间为25-35°C和q_S,initial
0.2-0.6 g/g/h的DoE实验；3) 使用扫描电镜(SEM)定量IBs粒径分布；4) 结合衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)和圆二色谱(CD)解析二级结构；5) 建立Gyrolab? xPand自动化ELISA系统测定RY；6) 应用MODDE?软件进行多变量统计分析。

3.1 主要USP结果
通过比较中心点实验证实工艺重现性良好。q_S,initial
和温度的双变量分析显示，仅q_S,initial
及其平方项对IBs滴度有显著影响(R²
=0.912)。温度在模型扩展后显现二次方效应，最佳操作窗口为q_S,initial
0.4-0.68 g/g/h配合30-31°C。

3.2 重折叠得率与IBs特性
所有USP条件产生的IBs经标准化处理后，RY波动范围仅7.47%，且结合活性均提高18倍。IBs纯度(91.7%±1.9%)和粒径(429±22 nm)的微小差异均无统计学意义(p>0.05)。

3.3 蛋白质结构分析
FTIR揭示IBs中β-折叠占比高达80%，显著高于重折叠后的标准蛋白(减少30%)。CD检测验证了这一趋势，证实USP条件未改变IBs的固有结构特征。

3.4 模型扩展验证
响应面模型(RSM)优化后确定最佳参数组合(q_S,initial
=0.57 g/g/h，T=31°C)，实测滴度达3.91 g/L，较文献报道提高25%。

讨论部分深刻指出，scFvM属于典型的"经典IBs"(classical IBs)，其特性不受USP调控的特点与能形成"非经典IBs"(如含活性蛋白的hG-CSF)的蛋白质形成鲜明对比。这种差异可能源于目标蛋白本身的结构特性——天然高β-折叠含量的scFvM更易形成结构稳定的IBs聚集体。该发现为IBs分类提供了新思路：建议根据"是否纯形成IBs"和"结构可调性"作为新的分类标准。

这项研究的重要价值在于：首次系统证实对于某些特定蛋白(如scFvM)，USP优化只需关注滴度最大化；建立了IBs特性与重折叠性能的多参数关联分析方法；开发的高通量FTIR解析工具(https://ftiranalysis.streamlit.app/)和SEM图像处理算法为领域内提供了实用工具。未来研究可扩展至其他纯IBs形成蛋白，以验证这一规律的普适性，为生物制药工艺开发提供更精准的指导原则。