二维液相色谱/质谱联用技术在磷酰二胺吗啉寡核苷酸杂质表征中的创新工作流程开发

本研究针对磷酰二胺吗啉寡核苷酸(PMO)杂质分析的挑战，开发了一种基于强阳离子交换色谱(SCX)和亲水相互作用色谱(HILIC)的二维液相色谱/质谱(2D-LC/MS)工作流程。通过活性溶剂调制(ASM)解决维度间洗脱强度不兼容问题，结合多中心切割(MHC)技术，实现了PMO杂质的在线脱盐、正交分离和高分辨率质谱(HR-MS)鉴定。该工作首次将SCX与HILIC联用，为PMO治疗药物的杂质控制提供了高效分析平台。

　　

磷酰二胺吗啉寡核苷酸(PMO)作为新一代反义寡核苷酸(ASO)药物，已获批治疗杜氏肌营养不良症(DMD)等疾病。然而，其中性骨架特性使传统一维液相色谱(1D-LC)难以有效分离结构相似的杂质，且常用非挥发性盐体系与质谱不兼容。现有离子对反相色谱(IP-RP)存在氟化物环境风险，而二维液相色谱(2D-LC)在PMO分析领域尚未见报道。这些技术瓶颈严重制约了PMO药物的杂质表征与质量控制。

Sarepta Therapeutics的研究团队在《Journal of Chromatography A》发表研究，开发了SCX×HILIC 2D-LC/MS工作流程。通过优化铵甲酸盐缓冲体系解决质谱兼容性问题，采用ASM技术(稀释因子5)克服维度间溶剂强度差异，结合MHC实现目标峰精准转移。关键实验技术包括：1) 使用30-mer PMO加标n-1缺失杂质验证方法；2) 对比KCl与NH₄
HCO₂
对SCX分离的影响；3) 评估四种HILIC固定相保留特性；4) 建立自动化杂质分析流程，应用于22-30-mer PMO原料药。

3.1节显示，NH₄
HCO₂
替代KCl使n-C27/n-T24分辨率提升至1.39/0.84，同时消除质谱中钾加合物干扰。3.2节证实ACE HILIC-N柱对PMO-1保留最强，并能基线分离1.3%的酰胺杂质(M-27)。3.3节通过ASM-f5优化使2D峰形改善，成功区分共洗脱的n-A5与PMO-1(图5)。3.4节应用该工作流程鉴定出PMO-1中四大类杂质：早期洗脱区(A/B)含3'-端加合物(M+28/M+118)和碱基修饰(M+153)，主峰区含n-1缺失(n-A/n-G)，晚期洗脱区(C/D)富集n-T缺失和5'-端尾链缺失杂质(表4)。

研究结论表明，该技术首次实现SCX-HILIC联用分析PMO，杂质检测限达0.2%，显著优于行业1%鉴定阈值。通过四批次PMO-1分析证实方法稳健性，且在22-30-mer不同长度PMO中均检测到相同杂质类别，揭示生产工艺的共性特征。讨论部分强调，该平台不仅解决PMO分析中分辨率与质谱灵敏度的矛盾，其在线脱盐设计更大幅提升分析通量，为生物制药领域建立新的杂质表征标准。未来可通过扩展HILIC分离模式，将该平台应用于其他寡核苷酸药物的分析。